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材料與儀器
步驟
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
去除 RNA 酶的雙蒸水
10XRT-PCR 緩沖液（去除 RNA 酶的雙蒸水，100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/LKC1,15 mmol/LMgCl2)
2. 酶和酶緩沖液
MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（100~200U/ul)
SUPERaseINRNA 酶抑制劑（20U/ul;Ambion)
3. 核酸和寡核苷酸
dNTP 混合物（10 mmol/L，包含所有四種 dNTP)
隨機(jī)引物（5umol/L)
總 RNA(達(dá)到 2.5ug)
4. 實(shí)驗(yàn)器材
薄壁的 PCR 管
二、方法
1. 在冰上加 2ul50umol/L 的隨機(jī)引物到薄壁的 PCR 管中（一個(gè)反應(yīng)一管)。
2. 加入 2.5ug 的總 RNA。
3. 加入 4ul 的 10 mmol/LdNTP 混合物。
4. 添加去除 RNA 酶的雙蒸水（RNaSe-freeH20)，使體積達(dá)到 16ul。
5.70°C 加熱 10min, 變性二級(jí)結(jié)構(gòu)，然后立即放在冰上。
6. 加 2ul 的 10XRT-PCR 緩沖液。
7. 加1ul 的 20U/ulSUPERaselN。
8. 加1ul 的 100~200U/ulMMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶。
9.42°C 溫浴 1h。
10.95°C 加熱10min, 滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。
1. 緩沖液、溶液和試劑
去除 RNA 酶的雙蒸水
10XRT-PCR 緩沖液（去除 RNA 酶的雙蒸水，100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/LKC1,15 mmol/LMgCl2)
2. 酶和酶緩沖液
MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（100~200U/ul)
SUPERaseINRNA 酶抑制劑（20U/ul;Ambion)
3. 核酸和寡核苷酸
dNTP 混合物（10 mmol/L，包含所有四種 dNTP)
隨機(jī)引物（5umol/L)
總 RNA(達(dá)到 2.5ug)
4. 實(shí)驗(yàn)器材
薄壁的 PCR 管
二、方法
1. 在冰上加 2ul50umol/L 的隨機(jī)引物到薄壁的 PCR 管中（一個(gè)反應(yīng)一管)。
2. 加入 2.5ug 的總 RNA。
3. 加入 4ul 的 10 mmol/LdNTP 混合物。
4. 添加去除 RNA 酶的雙蒸水（RNaSe-freeH20)，使體積達(dá)到 16ul。
5.70°C 加熱 10min, 變性二級(jí)結(jié)構(gòu)，然后立即放在冰上。
6. 加 2ul 的 10XRT-PCR 緩沖液。
7. 加1ul 的 20U/ulSUPERaselN。
8. 加1ul 的 100~200U/ulMMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶。
9.42°C 溫浴 1h。
10.95°C 加熱10min, 滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。
11. 繼續(xù)擴(kuò)增步驟或停止反應(yīng)，-2°C 儲(chǔ)存。
深圳安培生物科技有限公司，是一家具有核心的技術(shù)實(shí)力、壹流的經(jīng)營(yíng)管理水平和完善的市場(chǎng)銷售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O(shè)在廣東，服務(wù)面向全國(guó)。安培生物集進(jìn)口試劑、實(shí)驗(yàn)室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開(kāi)發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供壹流的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號(hào)傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線，在各個(gè)領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供世界前沿水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機(jī)構(gòu)、高等院校等優(yōu)質(zhì)客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。
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