逆轉(zhuǎn)錄酶(RT-PCR)是存在于 RNA 病毒體內(nèi)的依賴 RNA 的 DNA 聚合酶。RT-PCR 實(shí)驗(yàn)中的逆轉(zhuǎn)錄酶需要具有以下三種活性：

1. 依賴 RNA 的 DNA 聚合酶活性：以 RNA 為模板合成 cDNA 的第一條鏈；

2. Rnase 水解活性：水解 Rnase 雜合體中的 RNA;

3. 依賴 DNA 的 DNA 聚合酶活性：以一條 DNA 鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈 DNA。

在選擇逆轉(zhuǎn)錄酶時(shí)，建議選擇無 RNaseH①活性（RNaseH-）的逆轉(zhuǎn)錄酶。具有 RNaseH 活性的逆轉(zhuǎn)錄酶的 RNaseH 活性會(huì)與聚合酶活性競(jìng)爭(zhēng) RNA 模板與 DNA 引物（或 cDNA 延伸鏈）形成的雜合鏈，并降解雜合鏈中的 RNA 鏈。被 RNaseH 活性所降解的 RNA 模板不能再作為合成 cDNA 的有效底物，降低了 cDNA 合成的產(chǎn)量與長(zhǎng)度。

一、實(shí)驗(yàn)流程：

1、從細(xì)胞材料中提取 RNA→RNA 加入到含有逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTPs 的反應(yīng)體系中→退火，引物與 RNA 鏈配對(duì)→延伸，逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ) cDNA 鏈變性→常規(guī) PCR 反應(yīng)流程（變性、退火、延伸，如此多次循環(huán)）。

2、RT-PCR“兩步法”與“一步法”

RT-PCR 的實(shí)驗(yàn)操作分為“一步法”與“兩步法”兩種。一步法 RT-PCR 能克隆微量 mRNA 而不需構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)（即 cDNA 合成與 PCR 反應(yīng)在同一 Buffer 及酶中進(jìn)行，一步法完成），省略了 cDNA 與 PCR 之間的過程。兩步法 RT-PCR 首先用反轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA，然后以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR，即 RNA 反轉(zhuǎn)錄與 PCR 擴(kuò)增分兩步進(jìn)行。一步法 RT-PCR 與兩步法相比快速、簡(jiǎn)便、減少了污染機(jī)會(huì)、減少了 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)、減少了 PCR 反應(yīng)的錯(cuò)配率。RT-PCR 兩步法的優(yōu)勢(shì)在于存在中間產(chǎn)物 cDNA，便于保存；且第二步 PCR 只取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物的 1/10 進(jìn)行反應(yīng)，有利于 PCR 條件的調(diào)整，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性強(qiáng)；兩步法可以在第二步 PCR 反應(yīng)體系中加入特異性引物，其靈敏度比一步法高；兩步法的實(shí)驗(yàn)預(yù)算要低于一步法。但是由于兩步法包括第一鏈 cDNA 合成和隨后的 PCR 反應(yīng)，容易產(chǎn)生污染問題。

二、實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)：

1、 RNA 提取一定要迅速，樣本要新鮮，組織盡量在液氮中研磨；

2、 RNA 提取完馬上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄不要拖延，新提的 RNA 很容易降解； 

3、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程，需建立無 RNAase 環(huán)境，以避免模板 RNA 降解；