細菌呼吸鏈復合物3（bc-1 complex）活性光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

（中文版）

主要用途

   細菌呼吸鏈復合物3（bc-1 complex）活性光度法定量檢測試劑是一種旨在使用還原性合成輔酶Q同功類似物和特異性抑制劑，通過反應系統(tǒng)測定樣品中細胞色素C還原后峰值的增高，即采用比色法測定樣品中酶活性的*而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種野生、培養(yǎng)或病原性細菌膜蛋白懸液樣品的輔酶Q-細胞色素C還原酶的特異性活性檢測。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應優(yōu)化，檢測敏感。

技術背景

細菌呼吸鏈復合物III，通常稱為輔酶Q－細胞色素C還原酶、細胞色素還原酶或bc1復合物（ubiquinol cytochrome c oxidoreductase；cytochrome reductase；bc1 complex），是細菌電子傳遞鏈的中心元素，位于革蘭氏陰性和陽性細菌（除大腸桿菌和古生菌等），包括光合成細菌的細胞膜上，為寡聚體膜蛋白復合物。細菌使用氧氣、氮、硫化物等作為終端電子受體。細菌復合物III含有三個亞單位，包括細胞色素b（Cytochrome b），細胞色素c1（cytochrome c1）和Rieske鐵硫蛋白（Rieske iron-sulfur protein），通過Q循環(huán)（Q cycle）進行催化作用。其特征性的酶活性是抗霉素敏感的輔酶Q－細胞色素C還原酶。復合物III催化氧化型細胞色素C被還原為還原型細胞色素C，細菌內電子由低電位的供體還原型泛醌（ubiquinol；UQH2）或還原型輔酶Q（reduced Coenzyme Q；CoQH₂）傳遞到細胞色素C或質體藍素（plastocyanin）上的能量轉移反應，進行呼吸鏈傳遞。細菌復合物3和復合物4的相互作用，形成泛醌氧化酶（quinol oxidase）。輔酶Q－細胞色素C還原酶反應系統(tǒng)測定氧化型細胞色素C的濃度變化。基于還原型泛醌或還原型輔酶Q底物，在抗霉素存在與否的情況下，通過輔酶Q-細胞色素C還原酶的催化，轉化成泛醌（ubiquinone；UQ）或輔酶Q（Coenzyme Q；CoQ），同時氧化型細胞色素C，轉化為還原型細胞色素C，在分光光度儀下產(chǎn)生吸光峰值的變化（550nm 波長），由此定量測定輔酶Q－細胞色素C還原酶的特異活性。其反應系統(tǒng)是：

Complex III

CoQH₂  +  2 ferricyt c³⁺  +  2H⁺  →  CoQ  +  2 ferrocyt c²⁺  +  4H⁺

↓Abs 550 nm             ↑Abs 550 nm

產(chǎn)品內容

   緩沖液（Reagent A）         20毫升

   反應液（Reagent B）            125微升

   陰性液（Reagent C）          2毫升

   底物液（Reagent D）        500微升

   專性液（Reagent E）         200微升

   穩(wěn)定液A（Reagent F1）         4管

   穩(wěn)定液B（Reagent F2）        5毫升

產(chǎn)品說明書           1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；   反應液（Reagent B）和   底物液（Reagent D），避免光照，有效保證3月

用戶自備

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

培養(yǎng)箱：用于孵育反應物

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；   反應液（Reagent B）和   底物液（Reagent D）注意避光。 

一、 測定準備

1． 準備好待測樣品（例如細菌膜蛋白樣品等），置于冰槽里 

2． 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為550nm，間隔60秒，讀數(shù)3次（共2分鐘），并置零

3．    緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

4． 實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的   穩(wěn)定液B（Reagent F2）置入冰槽里融化，然后移出1毫升到   穩(wěn)定液A（Reagent F1）管里，混勻后，標記為   穩(wěn)定工作液，置于冰槽里備用（注意，15分鐘內使用，用完后丟棄）。然后將－20℃冰箱里的試劑盒中的   反應液（Reagent B）室溫下融化，然后移出10微升到新的1.5毫升離心管，加入10微升   穩(wěn)定工作液，輕柔混勻后，室溫下避光靜置15分鐘（可見顏色變白），標記為   反應工作液。然后即刻進行下列操作。

二、 背景對照測定

1． 移取870微升   緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入10微升   反應工作液 

3． 加入20微升   底物液（Reagent D）

4． 室溫下靜置10分鐘，避免光照

5． 加入100微升   陰性液（Reagent C）

6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內）

7． 即刻放入分光光度儀檢測，此為背景空對照：550波長讀數(shù)1分鐘或2分鐘－550波長讀數(shù)0分鐘 

三、 樣品總活性測定

1． 移取870微升   緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入10微升   反應工作液

3． 加入20微升   底物液（Reagent D）

4． 室溫下靜置10分鐘，避免光照

5． 加入100微升待測樣品（注意：15微克細菌膜蛋白）

6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內）

7． 即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：550波長讀數(shù)1分鐘或2分鐘－550波長讀數(shù)0分鐘

四、 樣品非特異活性測定

1． 移取850微升   緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入10微升   反應工作液，避免光照

3． 加入20微升   底物液（Reagent D）

4． 室溫下靜置10分鐘，避免光照

5． 加入20微升   專性液（Reagent E）

6． 加入100微升待測樣品（注意：15微克細菌膜蛋白）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內）

8． 即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)：550波長讀數(shù)1分鐘或2分鐘－550波長讀數(shù)0分鐘

五、 計算樣品活性

1）樣品活性（總活性和非特異活性）

【（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)】÷【0.1（樣品容量；毫升）X 21.84（毫摩爾吸光系數(shù) X 1或2（反應時間；分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾CoQH₂（還原型泛醌）/分鐘

2）樣品特異活性

樣品總活性－樣品非特異活性＝樣品特異活性

毫克/毫升＝單位/毫克

注意事項

1． 本產(chǎn)品為21次操作（10個樣本），包括1次背景對照測定

2． 操作時，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

4． 如果增強酶活檢測，建議使用細菌膜蛋白樣品。推薦使用   細菌呼吸鏈復合物檢測樣品制備試劑盒－   15142

5． 每增加1個樣品，增加   反應工作液為：   反應液（Reagent B）5微升＋   穩(wěn)定工作液5微升，以此類推。配制反應工作液時，須根據(jù)樣本數(shù)量配制實際工作液容量

6． 用戶可以根據(jù)實際樣品，計算   緩沖液（Reagent A）、   反應工作液和   底物液（Reagent D）三者之和，混勻后，室溫下靜置10分鐘后，即刻檢測

7． 加入樣品啟動反應后3秒內即刻比色測定

8． 分光光度計波長嚴格設置在550nm，誤差10nm將不產(chǎn)生信號

9． 測定可以持續(xù)2分鐘

10． 測定值由低到高變化，即2分鐘測定讀數(shù)高于0分鐘測定讀數(shù)，表明有酶活性

11． 比色測定后，比色皿須清洗*

12． 建議用戶使用分光光度儀檢測，總體系減半可以增加檢測樣本數(shù)

13． 建議待測樣本膜蛋白濃度為15微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調整（本公司提供Bradford蛋白質濃度定量試劑盒   30030.1）

14． 如果使用細菌裂解懸液，則蛋白濃度為50微克/100微升

15． 樣品特異活性是指抗霉素敏感的輔酶Q－細胞色素C還原酶，去除其它干擾因素（例如復合物I/II/IV等）

16． 細菌呼吸鏈復合物III（輔酶Q－細胞色素C還原酶）單位活性定義為：在30℃，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型泛醌（CoQH₂）所需的酶量作為一個活性單位

17． 本公司提供系列細菌酶類技術產(chǎn)品

質量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準確