實驗名稱：超聲實現(xiàn)離體H-22腫瘤細胞快速磁性標記研究

研究方向：生物醫(yī)學

測試目的：

細胞磺性標記所采用的標記物多為超順磁氧化鐵(SPIO)納米微粒，由于細胞膜表面和SPIO表面都帶負電荷，二者相互排斥，細胞在自然狀態(tài)難以攝取氧化鐵顆粒。為提高細胞標記率，達到磁性標記細胞的目的，一般都是通過載體或轉(zhuǎn)染劑對顆粒表面進行修飾，通過吞噬、液相胞飲等作用促進細胞對它們的攝取。近年還有人將磁性粒子與抗體和受體結(jié)合，通過細胞表面相應(yīng)的受體使磁性粒子與細胞結(jié)合并進入細胞內(nèi)。還可將磁性氧化鐵粒子制成特定的標記物，通過哺乳類動物細胞非特異性膜表面吸收過程進入細胞內(nèi)，用SPIO對目標細胞標記時，將SPIO與與轉(zhuǎn)染試劑通過一定方式復合，然后與目標細胞一起放入培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)，一般需要較長的孵育時間(24一48h)。SPIO微粒通過非特異性膜表面吸收過程進入細胞內(nèi)。

葡聚糖包被的超小型超順磁納米粒子是目前應(yīng)用最為廣泛的磁共振成像對比劑，最早被用于體外細胞磺性標記試驗。但相比于標準尺寸(50-150nm)或微米級的氧化鐵微粒對比增強效果也較弱。使用體積大些的葡聚糖包被的SPIO標記細胞時胞質(zhì)內(nèi)Fe顆粒較顆粒小者多，標記效果好。另外，用大尺寸的如微米級尺寸的氧化鐵微?？蓪崿F(xiàn)對單個細胞的磁標記進而實現(xiàn)單細胞的磁共振成像。這也是目前一個嶄新的研究方向，但由于細胞膜的保護作用，如何將這些大尺寸的氧化鐵微粒加載進入細胞質(zhì)中是一個有待解決的問題。

測試設(shè)備：ATA-8202射頻功率放大器、信號發(fā)生器、超聲探頭、水槽、蒸餾水等。

實驗過程：

利用化學共沉淀法自行合成葡聚糖包被的超順磁納米氧化鐵水基磁懸液，其核心顆粒直徑10~20nm，濃度可以根據(jù)需要自行調(diào)整。在此之前，曾經(jīng)采用生化孵育的安全質(zhì)量分數(shù)為25ug/mL且在輸出電功率1W的條件下進行了裝載實驗，發(fā)現(xiàn)作用時間在2min以內(nèi)該功率的超聲對細胞活性幾乎沒有影響，但由于細胞懸液中SPIO微粒濃度太小，裝載效果不理想。所以本次實驗選用較大的SPIO濃度，按其在細胞懸液中的最終濃度分為A、B、C、D、E5組，各組質(zhì)量分數(shù)為分別為22.5、90、410、1500、2250ug/mL且使超聲發(fā)生器輸出電功率為2W時進行超聲裝載實驗，實驗裝置如圖：

圖1：實驗裝置

實驗結(jié)果：

本次實驗考察當探頭激勵頻率1.43MHz，發(fā)生器輸出電功率2w，細胞懸液中所含SPIO質(zhì)量分數(shù)在22.5~2250ug/mL，，超聲作用時間在10~120s條件下，細胞標記情況及活性。

1、細胞標記結(jié)果

普魯士藍顯示陽性的為已標記的細胞，當SPIO在細胞懸液中質(zhì)量分數(shù)為410ug/mL，超聲發(fā)生器輸出電功率為2w，探頭中心頻率1.43MHz，超聲作用10s時H-22細胞的標記效果，細胞陽性率約為82%。而未經(jīng)超聲處理的細胞懸液，將其與納米超順磁氧化鐵水基磁懸液一起在37℃孵育箱中孵育30min，然后用普魯士染色，光鏡下觀察，幾乎沒有細胞被標記，可見不經(jīng)超聲處理，僅進行短時間孵育細胞是不能實現(xiàn)細胞標記，也就是說在沒有超聲的參與情況下，短時間內(nèi)SPIO微粒不能夠進入細胞內(nèi)。證明超聲作為一種外界力量確實可以使大顆粒物質(zhì)一納米氧化鐵微粒進入細胞，實現(xiàn)細胞磁性標記。

為了研究細胞的標記率與超聲處理時間、SPIO濃度之間的量化關(guān)系，在聲學條件為1.43MHz，輸出電功率為2W時，對不同的超聲處理時間、SPIO濃度條件下，任取10個顯微視野進行計數(shù)，統(tǒng)計SPIO對細胞的標記率。統(tǒng)計結(jié)果顯示不同SPIO濃度時細胞標記率(%)與超聲處理時間t(s)之間的關(guān)系如圖2。

圖2不同SPIO濃度時超聲輻射時間與細胞標記率之間的關(guān)系

特定SPIO濃度時，標記率和超聲作用時間的關(guān)系：當SPIO質(zhì)量分數(shù)為22.5ug/mL時，隨著超聲作用時間增長，細胞標記率近似直線提高，但從整體來看，細胞標記率較低，當超聲作用時間為120s時，標記率不足25%。當加入的SPIO質(zhì)量分數(shù)為90~2250ug/mL時，標記率和超聲作用時間呈現(xiàn)振蕩關(guān)系。除410ug/mL外，超聲作用時間低于30s，隨時間延長標記率下降。30~60s之間，隨時間延長，標記率提高；60s后，隨時間延長，標記率又呈下降趨勢。

超聲作用時間一定，標記率和SPIO濃度間關(guān)系，從整個標記結(jié)果來看，超聲作用時間在60s內(nèi)，細胞標記率相對較高，超過60s后，標記率基本都在下降。當超聲作用時間為30s，SPIO質(zhì)量分數(shù)為410ug/mL(C組)，細胞標記率超過90%，SPIO質(zhì)量分數(shù)過高(如1500ug/mL(D組)和2250ug/mL(E組))或質(zhì)量分數(shù)過低(如22.5ug/mL(A組))細胞標記率均不足20%；說明SPIO在對H-22細胞標記時存在一個最佳濃度，濃度過高或過低，都會使標記效果變差。

標記率與SPIO質(zhì)量分數(shù)、超聲作用時間之間確切關(guān)系還需進一步研究。

安泰ATA-8202射頻功率放大器：

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