好的引物會(huì)讓 PCR 實(shí)驗(yàn)成功一半，因而，引物設(shè)計(jì)一直都是 PCR 非常重要的環(huán)節(jié)。經(jīng)典之法就是讓 Premier5 攜手 oligo，共同設(shè)計(jì) PCR 引物。

1、以小鼠的 IL-17 為例，進(jìn)入 NCBI 界面,選擇 Nucleotide 后，輸入 IL-17，點(diǎn)擊 search。然后選擇人類(lèi) IL-17 的 mRNA，在 CDS 選項(xiàng)中，找到編碼區(qū)所在位置，在下面的 origin 中，
選定目的序列。

2、打開(kāi) Primer Premier5 軟件，點(diǎn)擊菜單欄 File|New|DNA Sequence，在出現(xiàn)的對(duì)話(huà)框里黏貼目的序列，并在 paste 對(duì)話(huà)框里選擇 As Is，點(diǎn)擊 OK。

3、點(diǎn)擊 Primer，彈出菜單后點(diǎn)擊 search 按鈕。在彈出的 Search Criteria 中，選擇 PCR primers，Pairs 參數(shù)，并選擇所需PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度，點(diǎn)擊 OK。在彈出的 search progress 菜單中，點(diǎn)擊 OK。

4、在搜索出的結(jié)果列表里選擇 Rating 值高，bug 較少的引物#1，在 Primer Premier 中選擇 S（正義鏈）/A（反義鏈），點(diǎn)擊 edit primer，將所得引物改成為 Rating 值為 100，無(wú) bug 的引物，即無(wú)發(fā)夾（Hairpin）、無(wú)二聚體（Dimer）、無(wú)錯(cuò)配（False Priming）和交叉配對(duì)（Cross Dimer）的引物。點(diǎn)擊 Accept and Quit 命令即可。

5、點(diǎn)擊菜單欄中 Edit∣Copy∣Sense Primer/Anti-sense Primer，即可得到設(shè)計(jì)的引物。

6、接下來(lái)，就要用 Oligo 軟件驗(yàn)證評(píng)估 Premier5 軟件所設(shè)計(jì)的引物，單擊菜單欄里 File∣New Sequence 可打開(kāi)以下窗口，并將設(shè)計(jì)好的上游引物黏貼在空白框里。

7、點(diǎn)擊菜單欄里 Accept/Discard 中的 Accept，則會(huì)出現(xiàn) Tm、△G 和 Frq 三個(gè)窗口, △G 值反應(yīng)了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度，最好引物的△G 值在 5’端和中間值比較高，而在 3’端相對(duì)較低。

8、點(diǎn)擊菜單欄里的 Select 中的 Upper Primer 將當(dāng)前引物設(shè)置為上游引物。同時(shí)點(diǎn)擊菜單欄里的 Edit 中的“Lower Primer”命令，在 Edit Lower 窗口中輸入下游引物的序列。點(diǎn)擊 Accept and Quit 命令即可。

9、最后，在菜單欄中 Analyze 完成引物△G 值、Tm 值、引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的分析后，可將引物序列送至公司進(jìn)行合成即可。

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