?抗體發(fā)現(xiàn)是開發(fā)單克隆抗體藥物、雙特異抗體藥物、ADC 藥物和Car-T細胞治療藥物的必經(jīng)之路。目前，單克隆抗體發(fā)現(xiàn)的技術(shù)主要有雜交瘤技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)和單B細胞篩選技術(shù)。其中單B細胞篩選技術(shù)由于其研發(fā)周期短而備受矚目。

該技術(shù)將單細胞分離鑒定與分子生物學(xué)結(jié)合，獲得單個B細胞抗體基因并進行體外克隆和表達，獲得的抗體保證了輕重鏈可變區(qū)的天然配對；相較于傳統(tǒng)的抗體制備技術(shù)，具有效率高、全人源、基因多樣性豐富、細胞數(shù)量少、周期短、適用于任意動物抗體篩選等優(yōu)點。但是，由于抗原特異性細胞的比例較低，需要借助高通量及高靈敏的分選系統(tǒng)對少量的特異性 B 細胞進行富集。

近期，Amgen提出了一種使用CellCellector 全自動無損細胞分離系統(tǒng)從用重組治療蛋白EGFR 免疫的Xeno Mouse R（XM）中分離單個抗原特異性原代B細胞的方法。這種方法為抗原特異性抗體的分離和驗證提供了一個快速、高效和經(jīng)濟的平臺。

整篇研究，思路清晰，流程簡單，解析如下：

1 使用CellCelector Flex全自動無損細胞分離系統(tǒng)分離EGFR特異性B細胞

從三只接種EGFR-ECD（EGFR的ECD結(jié)構(gòu)域）的小鼠身上獲得了200 萬個CD138 陽性的抗體分泌細胞（antibody-secreting cells，ASCs），這些小鼠顯示出EGFR滴度。CD138（Syndecan-1）的表達已被用于廣義地定義ASC 群體。

1、我們將60,000個細胞加載到包含約60,000個納米孔/孔的六孔板（CellCelector特色耗材）中，以實現(xiàn)平均每個納米孔一個細胞。

2、將抗人IgG Fc 特異性beads、抗人IgG連接的Alexa Fluor647（AF647）、生物素化的EGFR和AlexaFluor488（AF488）連接的鏈霉親和素的混合物與細胞進行孵育。

3、通過CellCelector的明場和熒光通道成像功能掃描了52,000個納米孔，以確定含有分泌抗體（AF647+）和與EGFR結(jié)合陽性（AF488+）的B細胞。

4、最終確定了1,189個含有ASCs（IgG-AF647陽性）的納米孔和238個含有EGFR特異性ASCs（AF488和AF647雙陽性）的納米孔，利用CellCelector導(dǎo)出94個EGFR陽性的ASCs用于IgG重鏈和輕鏈的分子回收（圖1）。

圖1. 雙陽性細胞的代表性熒光和明場圖像。

A) 647nm發(fā)射波長的熒光特異性圖像（紅色）；觀察到兩個鄰孔含有ASCs；(B) 488nm發(fā)射波長的熒光特異性圖像（綠色），觀察到相鄰的一個孔含有EGFR特異性的ASC；(C)647和488nm通道的圖像疊加；(D)用于挑選EGFR+ASC的明場圖像；(E)從納米孔中挑取EGFR+ASC之前的明場圖像和(F) 從納米孔中挑取EGFR+ASC之后的明場圖像。

CellCelector 的優(yōu)勢在于：

1、用于自動調(diào)整毛細管高度的SurePick™ 技術(shù)，在挑選過程中對毛細管高度進行動態(tài)調(diào)整，允許從高度不平或半固體表面進行高效的全自動挑選

2、用于高通量篩選的Nanowell 納米孔板技術(shù)，每個納米板含有十萬到數(shù)百萬個納米孔，實現(xiàn)更高通量的細胞分選

3、支持全板掃描，每次挑取僅需20-30s，實驗操作時間短，自動化程度高

4、全流程存檔記錄及質(zhì)量控制，完全自動化的質(zhì)量控制過程，包括揀選前后的圖像、揀選/失敗報告和數(shù)據(jù)/圖像輸出

5、適用于貼壁細胞，懸浮細胞或半固體培養(yǎng)基中的細胞；單細胞，細胞團，球體或菌落；原代細胞或細胞系；活細胞或固定細胞

6、一機全能，集分選、成像和挑取為一體

2 通過iQue® 高通量流式細胞儀在細胞水平檢測抗體結(jié)合能力

通過RT-PCR進行IgG重鏈和輕鏈擴增并進行了測序，成功克隆、表達和純化了20個獨特的抗體序列。這20個序列被克隆到人IgG1同型的表達載體中，瞬時轉(zhuǎn)染到293T細胞，5天后收獲含有抗體的培養(yǎng)基上清，使用Octet® 對上清液進行定量分析，確定其濃度在22至398mg/L之間。使用iQue3® 高通量流式細胞儀測定20種表達抗體與CHO細胞上瞬時表達的EGFR的特異性結(jié)合（圖2A）

圖2. 20個表達的克隆的表征。

(A)通過流式細胞儀測定抗體與表達EGFR的CHO細胞的結(jié)合；(B)用BLI測定抗體對可溶性EGFR的親和力；(C)三個有代表性的親和力檢測結(jié)果圖顯示了與可溶性EGFR的高親和力（<1nM）、中等親和力（1-10nM）和無結(jié)合。

iQue® 高通量流式的優(yōu)勢在于：

1、氣泡分隔的連續(xù)采樣技術(shù)，使流式細胞術(shù)進入高通量篩選(HTS)領(lǐng)域

2、最小樣本體積達到10uL，支持384、1536孔板采樣，96孔板只需5min

3、ForeCyt軟件、比起傳統(tǒng)流式更簡單的使用及維護，硬件配套軟件，是高通量流式篩選必備儀器

3 Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)從分子水平檢測抗體結(jié)合能力

通過Octet® 測定抗體對可溶性EGFR的親和力。AHC傳感器固化抗體，然后與EGFR結(jié)合解離，EGFR的濃度范圍為1.56nM至100nM。結(jié)果分為3類：高親和力（<1nM）、中等親和力（1–10nM），與可溶性EGFR無結(jié)合（圖2B和C）。流式結(jié)果和Octet®檢測結(jié)果一致。因此，能夠確認來自原代B細胞的分離序列與天然EGFR細胞和可溶性EGFR蛋白有明顯結(jié)合。

Octet®非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)的優(yōu)勢在于：

1、非標(biāo)記Direct binding是趨勢，結(jié)果更準確

2、快速測定親和力，更加定量化地表征分子互作

3、無洗滌步驟，可測弱親和力（解離快）

4、寫入了美國藥典，文章多，認可度廣

5、萬金油技術(shù)，可以用于檢測DNA，小分子，蛋白質(zhì)等各種生物分子；如這篇文章檢測的就是病毒顆粒樣品

6、操作簡便，耗材及維護成本低

7、高通量，本文使用RH96，可以同時檢測96個樣品

總結(jié)

本研究通過CellCelector平臺快速高效的篩選和分離ASCs，獲得陽性B細胞序列后，結(jié)合iQue® 高通量流式細胞平臺以及Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)，3-4周內(nèi)成功獲得抗原特異性抗體，為大家解析了如何利用賽多利斯新三劍客快速高效的進行高單B細胞篩選的典型流程，為新型抗體藥物的發(fā)展指引了新的方向。