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懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)節(jié)及免疫熒光IF經(jīng)驗(yàn)分享
細(xì)胞培養(yǎng)類型可以分為貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞兩種，只有極少數(shù)類型細(xì)胞同時(shí)存在兩種狀態(tài)。
懸浮細(xì)胞是指不需要依賴支持物，可在培養(yǎng)基中以懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)的一類細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞和大部分血液系統(tǒng)來(lái)源細(xì)胞。（如小鼠白血病細(xì)胞WEHI-3, 人白血病細(xì)胞K-562, HL-60）。工業(yè)上也有越來(lái)越多的貼壁傳代細(xì)胞被馴化出來(lái)，進(jìn)行全懸浮的培養(yǎng)。目前在工業(yè)中應(yīng)用的主要有SP2/0、NS0、CHO、BHK和HEK293細(xì)胞等，它們主要用于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)；在獸用生物制品中常用的傳代細(xì)胞主要有采用全懸浮培養(yǎng)的BHK21細(xì)胞、MDCK細(xì)胞；及借助微載體懸浮培養(yǎng)的Vero細(xì)胞、PK細(xì)胞、ST細(xì)胞、 Marc145細(xì)胞等，每種細(xì)胞的特性都不同。
一般情況下，懸浮細(xì)胞相較于貼壁細(xì)胞的處理更加簡(jiǎn)單一些，因?yàn)閼腋〖?xì)胞傳代時(shí)無(wú)須胰酶消化。但這并不意味著懸浮細(xì)胞比貼壁細(xì)胞好養(yǎng)，對(duì)新手來(lái)說，反而更具挑戰(zhàn)性。總是會(huì)遇到各種各樣的問題：比如，為什么總是出現(xiàn)死細(xì)胞和細(xì)胞分化；說好了傳代很easy的，結(jié)果會(huì)出現(xiàn)分化；養(yǎng)好了凍存復(fù)蘇后又出現(xiàn)問題了！
養(yǎng)好懸浮細(xì)胞，有如下大眾經(jīng)驗(yàn)分享。
要點(diǎn)一：足夠的耐心，這是非常必要的
很多懸浮細(xì)胞在剛從凍存狀態(tài)復(fù)蘇時(shí)活力是相對(duì)較差的，此時(shí)我們需要有足夠的耐心，等待細(xì)胞完成自我修復(fù)進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期。比如THP-1（人單核細(xì)胞白血?。慕鈨龅交謴?fù)正常增殖往往需要7-10天的恢復(fù)期；Jurkat，Clone E6-1(人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞)復(fù)蘇后也需要5-7天才能恢復(fù)到凍存前的狀態(tài)。新手可能會(huì)在此期間放棄培養(yǎng)，所以，請(qǐng)多一點(diǎn)耐心哦！培養(yǎng)這類細(xì)胞也是培養(yǎng)耐心的過程呢！
要點(diǎn)二：接種密度的把握
一般來(lái)說，懸浮細(xì)胞接種時(shí)密度不應(yīng)低于50萬(wàn)個(gè)/ML，很多懸浮細(xì)胞有密度依賴，密度低導(dǎo)致的不增殖也是新手常見問題之一。當(dāng)然，有極少數(shù)細(xì)胞在密度高時(shí)反而狀態(tài)變差，如W6/32（小鼠B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞）。因此，培養(yǎng)不了解的細(xì)胞前查找相關(guān)資料去掌握細(xì)胞特性非常重要。
要點(diǎn)三：換液方法及頻率
換液頻率不應(yīng)該被限制得“明明白白”，細(xì)胞是活物，在一個(gè)連續(xù)培養(yǎng)周期內(nèi)，視細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)可分多次添加補(bǔ)充培養(yǎng)基、葡萄糖等特定營(yíng)養(yǎng)成份，維持細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。懸浮培養(yǎng)過程中，隨著細(xì)胞的增殖，原有培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，代謝產(chǎn)物的增加，細(xì)胞的活率會(huì)下降，及時(shí)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使細(xì)胞處于一個(gè)相對(duì)良好的生存環(huán)境。切忌頻繁離心換液。參考換液方法：
①離心全換液法
即通過離心（800-1000rpm，5min）去除全部舊的培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基。該方法適合“皮實(shí)“好養(yǎng)的懸浮細(xì)胞換液(如K562)，或者當(dāng)前細(xì)胞狀態(tài)良好、密度較高導(dǎo)致培養(yǎng)基消耗較大的情況。此方法的優(yōu)點(diǎn)是換液到位，能去除部分細(xì)胞碎片，但是同樣會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定程度的機(jī)械損傷。
②離心半換液法
即通過離心（800-1000rpm，5min）50%細(xì)胞懸液，更換50%體積的新鮮培養(yǎng)基。該方法適合比較“矯情“難養(yǎng)的細(xì)胞（如thp-1），或者正在調(diào)整狀態(tài)中、密度較低但碎片較多需要去除的情況。
③沉降換液法
即不使用離心機(jī)而是利用重力自然沉降的方法，將培養(yǎng)基與細(xì)胞分離，達(dá)到全部或部分更換新鮮培養(yǎng)基。但是其有應(yīng)用局限性—只適合能成一定大小細(xì)胞團(tuán)（否則無(wú)法自然沉降，只能低速離心）的細(xì)胞，尤其是處理依賴細(xì)胞聚集才能增殖的細(xì)胞時(shí)非常值得推薦，如NK-92、NK-92 MI、Jurkat。該方法能在換液過程中最大限度避免離心過程造成的機(jī)械損傷，同時(shí)保留聚集的細(xì)胞團(tuán)，并且去除細(xì)胞碎片也較為干凈。
固定懸浮細(xì)胞，有如下私房經(jīng)驗(yàn)分享。
養(yǎng)好懸浮細(xì)胞，需要用化合物等試劑刺激懸浮細(xì)胞，或者共培養(yǎng)。使用免疫熒光來(lái)檢查懸浮細(xì)胞，一直給很多新手，甚至高手造成心理陰影。如何固定好懸浮細(xì)胞？如何確保不掉片？甚至如何讓懸浮細(xì)胞貼壁來(lái)做實(shí)驗(yàn)？是很多實(shí)驗(yàn)者的奢望。懸浮細(xì)胞固定/免疫熒光專用玻片給帶來(lái)解決方案。
如下是一些懸浮細(xì)胞固定后做的免疫熒光圖片，可以參考。
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