1. 制備瓊脂糖微球

按照一定的瓊脂糖濃度通過加熱進行溶解（一般為4%或6%，相對較小的濃度制備的微球孔徑較大），攪拌后得到均勻的水相溶液。溫度越高，瓊脂糖的粘度就越低。

不同濃度的瓊脂糖黏度不一樣，一般來說濃度越大粘度越高，需要溶解的時間越長；在相同的加熱時間上，一般來說濃度越大所形成的微粒粒徑也越大。

加熱時間的長短也會對后續(xù)成球造成一定影響，如果時間過短，那么瓊脂糖并未溶解或者是黏度較大，則會形成較大顆粒，且分散系數(shù)也不理想；

如果時間過長，則因在高溫下瓊脂糖可能會發(fā)生一定程度的水解，分子量下降，黏度降低，此時有利于在分散相中形成較為均勻的微球。但是如果時間過長，瓊脂糖鏈變得過短，則會對球形度產(chǎn)生影響，同時也會影響機械強度。

制備分散相

將Span 80溶解在有機溶劑（可選種類很多，推薦用液體石蠟等）中，加熱到80℃。

乳化

將Step 1中的瓊脂糖溶液導入Step 2中的分散相，不斷攪拌，乳化20min左右。

如果乳化劑用量不足，則會造成威力，球形度不夠，球與球之間發(fā)生粘連；而過多的乳化劑則會造成一定程度的氣泡，影響微球的均勻性。

此外攪拌速度和成球之后的半徑成反比，這是因為在更大轉(zhuǎn)速下，更高的剪切力的作用下乳滴會形成更小的顆粒。

4. 固化成球

逐漸降低溫度（建議1-2℃/min），降低到室溫后瓊脂糖微球基本就成型了。加入去離子水并靜置2小時以上，對微球進行洗滌去除有機相，得到未交聯(lián)的瓊脂糖微球。

如果固化時間過短，則會導致微粒粒徑分布過大，也會有較多的顆粒聚集在一起，形成較大顆粒，是平均粒徑偏大。

5. 進行交聯(lián)

微球可以在堿性條件下與交聯(lián)劑反應，常用的交聯(lián)劑有環(huán)氧氯丙/烷等短鏈交聯(lián)劑、丙二醇縮水甘油醚等長鏈交聯(lián)劑，也可以分別用短鏈、長鏈交聯(lián)劑進行交聯(lián)，一般先采用長鏈交聯(lián)劑，再用短鏈交聯(lián)劑，這樣得到的瓊脂糖微球機械性能會更好。

一般交聯(lián)步驟如下：例如每100g瓊脂糖脫水微球，加入到100 ml 1M氫氧化/鈉，再加入2ml環(huán)氧氯丙/烷，2g硼氫化/na室溫下攪拌一小時，再加熱到60度攪拌一小時，后用冷水清洗備用。

在一定范圍內(nèi)的增加交聯(lián)時間，瓊脂糖微球的孔隙率得到一定程度的提升；當然不同分子量的瓊脂糖形成的微球孔徑也會有所不同，一般來說，大分子量的形成的孔會更小。

瓊脂糖微表面帶有負電荷，可能會對后續(xù)的層析分離，造成一定程度的影響，在表面修飾進行改善。