在體內(nèi)，最佳的T細(xì)胞活化既是一個(gè)機(jī)械過(guò)程，也是一個(gè)生化過(guò)程。Piezo1是一種機(jī)械敏感離子通道，響應(yīng)物理力，例如流體剪切應(yīng)力（FSS）而開(kāi)放，并允許鈣離子內(nèi)流。鈣內(nèi)流導(dǎo)致 Piezo1 將物理刺激轉(zhuǎn)化為生化反應(yīng)，因?yàn)殁}是參與多種信號(hào)通路的第二信使。其中一條通路是T細(xì)胞活化，因?yàn)殁}內(nèi)流會(huì)增加活化T細(xì)胞核因子（NFAT）、核因子κB（NF-κB）和激活蛋白1（AP-1）的活化。然后，這些轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這些細(xì)胞因子在持續(xù)的T細(xì)胞活化、分化和細(xì)胞毒性中起重要作用。先前的一項(xiàng)研究表明，流體剪切應(yīng)力（FSS）誘導(dǎo)單個(gè)T細(xì)胞中的鈣內(nèi)流，這表明通過(guò)Piezo1激活的FSS可能具有促炎作用。

在美國(guó)范德堡大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系的一項(xiàng)研究中，用FSS處理Jurkat和原代人T細(xì)胞，通過(guò)以0.5-5.0 dyn/cm2的FSS 梯度處理T細(xì)胞來(lái)研究生理性FSS的效果。然而，在病理生理學(xué)背景下，高血壓的血壓異常屬于血流動(dòng)力學(xué)的改變，與細(xì)胞因子水平異常相關(guān)，并與多種自身免疫性疾病相關(guān)。在高血壓患者血管網(wǎng)絡(luò)的某些區(qū)域，血流速度降低，F(xiàn)SS降低。在其他區(qū)域，血流速度增加，F(xiàn)SS升高。了解FSS與改變的T細(xì)胞活化之間的關(guān)系可以為高血壓患者自身免疫性疾病的治療確定新的治療靶點(diǎn)。這項(xiàng)研究是第一個(gè)確定FSS增強(qiáng)T細(xì)胞活化的研究，觀察結(jié)果表明，Piezo1和其他機(jī)械敏感離子通道可能是自身免疫性疾病的治療靶點(diǎn)，或用于改善過(guò)繼性T細(xì)胞免疫療法。

FSS 增強(qiáng)用 CD3/CD28 抗體處理的 Jurkat 細(xì)胞中的 ZAP70 磷酸化

利用永生化Jurkat細(xì)胞系，模擬CD3 / CD28抗體聯(lián)合體外FSS（5.0 dyn/cm2，1h）對(duì)T細(xì)胞的激活作用（圖1 A）。在整個(gè)FSS實(shí)驗(yàn)中，將剪切應(yīng)力值保持在靜脈和動(dòng)脈水平，分別為0.5-4.0 dyn/cm2和 4.0-30.0 dyn/cm2。為了確定FSS暴露水平是否對(duì)細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，測(cè)量了細(xì)胞活力。5.0 dyn/cm2 的FSS持續(xù)1小時(shí)未顯著降低細(xì)胞活力。

首先用不含抗體的FSS處理Jurkat細(xì)胞，以確定單獨(dú)FSS的激活作用。通過(guò)測(cè)量zeta鏈相關(guān)蛋白激酶-70（ZAP70）磷酸化來(lái)量化，ZAP70 在CD3激活后磷酸化，是T細(xì)胞活化的必要步驟。與靜態(tài)對(duì)照相比，單獨(dú)的FSS僅導(dǎo)致ZAP70磷酸化增加10%（圖1 B）。當(dāng)CD3/CD28抗體與FSS聯(lián)合時(shí)，與僅抗體或未處理的對(duì)照相比，ZAP70磷酸化顯著增加，約50%（圖1 C）。然后用不同幅度的FSS處理Jurkat細(xì)胞，以確定T細(xì)胞活化對(duì)剪切應(yīng)力的“幅度反應(yīng)”。實(shí)驗(yàn)觀察到ZAP70磷酸化的增加與FSS幅度呈正相關(guān)（圖1 D）。此外，還測(cè)量了Jurkat ZAP70磷酸化對(duì)FSS-抗體處理時(shí)間的依賴(lài)性。隨著FSS持續(xù)時(shí)間的增加，ZAP70磷酸化顯著增加（圖1 E）。

圖1   CD3 / CD28抗體和FSS處理對(duì)ZAP70的磷酸化作用。

FSS 聯(lián)合 CD3/CD28 抗體可增加 Jurkat 細(xì)胞中晚期 T 細(xì)胞活化標(biāo)志物的表達(dá)

為了正常激活T細(xì)胞，需要激活轉(zhuǎn)錄因子NFAT、NF-κB和AP-1來(lái)轉(zhuǎn)錄重要的蛋白質(zhì)和細(xì)胞因子，例如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-2和干擾素γ（IFN-γ）。實(shí)驗(yàn)用FSS聯(lián)合CD3/ CD28抗體刺激Jurkat細(xì)胞1小時(shí)后測(cè)量每個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的活化。結(jié)果觀察到，NFAT-核共定位顯著增加（圖2 A），而且FSS與CD3 / CD28抗體的組合顯著增加了NF-κB和AP-1的活化。

FSS處理1小時(shí)后測(cè)量細(xì)胞因子TNF-α，IL-2和IFN-γ的表達(dá)，以確定三種轉(zhuǎn)錄因子的激活增加是否與維持T細(xì)胞功能和激活所需的蛋白質(zhì)表達(dá)增加相關(guān)。與對(duì)照組相比，當(dāng)Jurkat細(xì)胞用FSS處理1小時(shí)時(shí)，每種細(xì)胞因子的表達(dá)均顯著增加。FSS處理后24小時(shí)后測(cè)量了活化標(biāo)志物CD69和CD25的表達(dá)。與對(duì)照組相比，F(xiàn)SS-抗體處理組和僅抗體處理組均顯示CD69和CD25表達(dá)增加。

FSS下CD3 / CD28抗體包被珠增加了Jurkat細(xì)胞的活化

實(shí)驗(yàn)還用CD3 / CD28抗體包被的磁珠測(cè)試了FSS，以確定FSS是否也可以增強(qiáng)使用磁珠激活的Jurkat細(xì)胞的活化。用或不用FSS聯(lián)合抗體包被的磁珠刺激Jurkat細(xì)胞1小時(shí)。與僅磁珠和未處理的對(duì)照相比，F(xiàn)SS處理顯著增加了ZAP70的磷酸化。與未處理的對(duì)照相比，單獨(dú)磁珠對(duì)照組的ZAP70磷酸化也顯著增加，但不如FSS處理組明顯（圖2 A）。此外，在用磁珠處理1小時(shí)后FSS也顯著增強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和cFOS的磷酸化。單獨(dú)磁珠對(duì)照組僅顯著增加了cFOS的磷酸化，而不是NF-κB（圖2 B、C）。當(dāng)用CD3 / CD28包被珠處理Jurkat細(xì)胞時(shí)，F(xiàn)SS也顯著增加了Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)。與對(duì)照組相比，TNF-α、IL-2和IFN-γ在FSS條件下均大幅上調(diào)（圖2 D）。

圖2   FSS通過(guò)CD3 / CD28包被磁珠增加活化。

FSS增強(qiáng)Jurkat細(xì)胞中T細(xì)胞的活化具有Piezo1 和鈣依賴(lài)性

為了確定FSS增強(qiáng)的T細(xì)胞活化是否通過(guò)鈣內(nèi)流起作用，在無(wú)鈣或含鈣的HBSS緩沖液中用抗體加FSS的組合處理Jurkat細(xì)胞1小時(shí)。用FSS和抗體在含鈣緩沖液中處理的Jurkat細(xì)胞顯示出ZAP70磷酸化顯著增加。在無(wú)鈣緩沖液中用FSS和抗體處理的Jurkat細(xì)胞沒(méi)有顯示出ZAP70磷酸化的顯著增加（圖3 A）。接下來(lái)，用或不用鈣螯合劑EGTA以2mM的濃度預(yù)處理Jurkat細(xì)胞30分鐘，觀察到用EGTA，F(xiàn)SS和抗體處理的Jurkat細(xì)胞ZAP70磷酸化顯著降低（圖3 B）。

為了確定Piezo1是否可能在FSS增強(qiáng)的T細(xì)胞活化中發(fā)揮作用，實(shí)驗(yàn)在FSS和抗體處理前30分鐘用10 μM GsMTx-4 處理Jurkat細(xì)胞。GsMTx-4是Piezo1的相對(duì)特異性抑制劑，但已知也會(huì)抑制其他機(jī)械敏感通道。GsMTx-4導(dǎo)致用FSS和抗體處理的Jurkat細(xì)胞的ZAP70磷酸化顯著降低（圖3 C）。這表明FSS通過(guò)誘導(dǎo)導(dǎo)致鈣內(nèi)流的機(jī)械敏感離子通道的激活來(lái)增強(qiáng)T細(xì)胞活化。為了更具體地量化Piezo1是負(fù)責(zé)FSS增強(qiáng)Jurkat細(xì)胞活化的離子通道的程度，利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除Jurkat細(xì)胞中Piezo1。在Jurkat Piezo1 敲除細(xì)胞中，與未處理或僅抗體處理的細(xì)胞相比，F(xiàn)SS處理不會(huì)增加ZAP70磷酸化。然而，在Cas9對(duì)照J(rèn)urkat細(xì)胞中，F(xiàn)SS處理顯著增加了ZAP70磷酸化。此外，當(dāng)兩者都用FSS處理時(shí)，與Jurkat Piezo1 敲除細(xì)胞相比，Cas9對(duì)照J(rèn)urkat細(xì)胞中的ZAP70磷酸化顯著更高（圖3 D）。

實(shí)驗(yàn)還研究了鈣內(nèi)流的下游效應(yīng)，以確定它們是否在FSS存在下增強(qiáng)T細(xì)胞活化方面發(fā)揮作用。肌動(dòng)蛋白聚合先前已被確定為有效T細(xì)胞活化所必需的，并受鈣內(nèi)流調(diào)節(jié)。在FSS處理前30分鐘用30 μM細(xì)胞松弛素D（CCD）預(yù)處理Jurkat細(xì)胞以抑制肌動(dòng)蛋白聚合。CCD顯著降低了與FSS-抗體處理相關(guān)的增加的ZAP70磷酸化，同時(shí)在僅抗體條件下沒(méi)有顯著改變Jurkat細(xì)胞的活化（圖3 E）。

鈣調(diào)磷酸酶是一種磷酸酶，在鈣內(nèi)流下游被激活，并與NF-κB激活有關(guān)。為了確定鈣調(diào)磷酸酶是否被鈣內(nèi)流激活以增加轉(zhuǎn)錄因子活化，通過(guò)用5 μM環(huán)孢菌素A（CSA）預(yù)處理Jurkat細(xì)胞30分鐘來(lái)抑制鈣調(diào)磷酸酶。CSA處理顯著降低了用FSS和抗體處理的Jurkat細(xì)胞中的NF-κB磷酸化，表明FSS激活鈣調(diào)磷酸酶以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子的激活（圖3 F）。

圖3   鈣內(nèi)流對(duì)于Jurkat細(xì)胞中FSS增強(qiáng)T細(xì)胞激活至關(guān)重要。

FSS增強(qiáng)原代T細(xì)胞的活化

為了獲得更生理性的T細(xì)胞活化模型，并確定FSS處理的活化效果是否與臨床中的T細(xì)胞療法相關(guān)，實(shí)驗(yàn)用抗體和FSS處理原代人T細(xì)胞1小時(shí)。FSS增強(qiáng)了CD4和CD8-陽(yáng)性T細(xì)胞亞群中ZAP70的磷酸化。這種趨勢(shì)在NF-κB磷酸化中也很明顯，CD4和CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的NF-κB磷酸化顯著增加。如上所述，細(xì)胞因子表達(dá)是T細(xì)胞活化和功能的另一個(gè)重要步驟。因此，F(xiàn)SS處理1小時(shí)后，測(cè)量?jī)蓚€(gè)亞群中原代T細(xì)胞的TNF-α，IL-2和IFN-γ的表達(dá)。在CD4和CD8陽(yáng)性T細(xì)胞中，與未處理和僅抗體的對(duì)照相比，用FSS和CD3 / CD28抗體處理T細(xì)胞時(shí)，所有三種細(xì)胞因子均顯著增加。

圖4   FSS和CD3 / CD28抗體增強(qiáng)T細(xì)胞活化的示意圖。

FSS激活Piezo1，使鈣流入。鈣內(nèi)流增加ZAP70磷酸化，并激活轉(zhuǎn)錄因子NFAT，NF-κB和AP-1。這反過(guò)來(lái)又導(dǎo)致細(xì)胞因子（如IL-2）的表達(dá)增加。

總之，該研究表明，5.0 dyn/cm2的生理FSS當(dāng)受到CD3/CD28抗體刺激時(shí)可以增強(qiáng)T細(xì)胞的活化。然而，該研究結(jié)果也可能與病理生理狀態(tài)有關(guān)，如高血壓。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)ZAP70磷酸化測(cè)量，F(xiàn)SS幅度的增強(qiáng)進(jìn)一步增加了T細(xì)胞活化。高血壓與身體某些部位（如左右頸總動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈）的血流速度增加有關(guān)，因此FSS增加。在這些疾病中，已知T細(xì)胞都起著重要作用。這項(xiàng)研究的結(jié)果以及高血壓與自身免疫性疾病之間的相關(guān)性表明，抑制T細(xì)胞中的Piezo1和其他機(jī)械敏感離子通道可能對(duì)自身免疫性疾病和細(xì)胞因子釋放綜合征具有治療潛力。

參考文獻(xiàn)：Hope JM, Dombroski JA, Pereles RS, Lopez-Cavestany M, Greenlee JD, Schwager SC, Reinhart-King CA, King MR. Fluid shear stress enhances T cell activation through Piezo1. BMC Biol. 2022 Mar 9;20(1):61. doi: 10.1186/s12915-022-01266-7. PMID: 35260156; PMCID: PMC8904069.