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大鼠環(huán)磷酸腺苷（cAMP）ELISA試劑盒

原理

本實驗采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗大鼠 cAMP 單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的 cAMP與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠cAMP，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍色，zui后加終止液，在450nm處測OD值，cAMP濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中cAMP濃度。

試劑盒組成（2-8℃保存）

準備試劑與收集血樣

1. 收集標本：血清、血漿（EDTA）、細胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿、尿液等盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復凍融。血清、血漿至少作1：2稀釋（取50ul，加標本稀釋液50ul,稀釋2倍）。細胞上清至少10倍稀釋。

2. 標準品液配制：使用前加入1ml蒸餾水混勻，配成1000pmol/ml的溶液。設標準管8管，*管加標本稀釋液900ul，第二至第八管加入標本稀釋液500ul。在*管中加1000pmol/ml的標準品溶液100ul混勻后用加樣器吸出500ul，移至第二管。如此反復作對倍稀釋，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對照。

3. 10×標本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。

4. 洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

檢測程序

1. 加樣：每孔各加入標準品或待測樣品100ul，將反應板充分混勻后置37℃120分鐘。

2. 洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。

3. 每孔中加入*抗體工作液100ul。將反應板充分混勻后置37℃60分鐘。

4. 洗板：同前。

5. 每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應板置37℃30分鐘。

6. 洗板：同前。

7. 每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應15分鐘。

8. 每孔加入100ul終止液混勻。

9. 30分鐘內(nèi)用酶標儀在450nm處測吸光值。

結(jié)果計算與判斷

1. 所有OD值都應減除空白值后再行計算。

2. 以標準品100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0 pmol/ml為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線。

3. 根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應cAMP含量，再乘上稀釋倍數(shù)即可。

試劑盒性能

  1.   靈敏度：zui小的cAMP 檢測濃度小于1pmol/ml。

2. 特異性：可同時檢測重組或天然的大鼠cAMP。不與大鼠其它細胞因子有交叉反應。

3. 重復性：板內(nèi)、板見變異系數(shù)均小于8.9％。

注意事項

  1.   以上標準孔及待測樣品均建議做復孔，每次測定應同時做標準曲線。

 2.   洗滌過程很關鍵。洗滌不充分將導致度誤差及OD值錯誤地升高。

  3.   板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。

  4.   本試劑盒宜置4oC冰箱保存。

 5.   本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！