隨著多重?zé)晒饷庖呓M化技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多老師希望在自己的片子上看到更豐富的靶標(biāo)信息，意味著我們需要用到更多種熒光染料去完成染色，但由于熒光染料產(chǎn)生的信號(hào)不是單純的線性，而是呈現(xiàn)山峰狀的分布，在最高點(diǎn)信號(hào)固然最好，但在最高點(diǎn)左右的一段范圍內(nèi)都能夠捕獲到它的信號(hào)，那么相鄰的染料之間，難免會(huì)有信號(hào)的重疊，導(dǎo)致最后的結(jié)果無法被準(zhǔn)確判讀。

不同熒光染料光譜示意圖

mIHC結(jié)果出現(xiàn)信號(hào)重疊，一般表現(xiàn)為兩種情況：

1、信號(hào)重疊，沒有各自獨(dú)立信號(hào)存在（理論上指標(biāo)間不存在共定位）

圖1：左：merge；中：CD4；右：CD8

2、有各自獨(dú)立的陽(yáng)性信號(hào)，但大部分信號(hào)高度重疊（理論上共定位信號(hào)沒有那么多）

圖2：左：merge；中：CD3；右：CD8

圖3：紅箭頭：共定位信號(hào)；白箭頭：CD8信號(hào)

可能原因：選用波長(zhǎng)十分相近的熒光染料進(jìn)行了染色；前一輪染色的抗體沒有洗滌干凈

解決方案：

1、在選擇熒光染料的時(shí)候，選擇相距波長(zhǎng)較遠(yuǎn)的熒光染料，以Absin的多色試劑盒為例，選擇四色（TSA520、TSA570、TSA650、DAPI）、五色（TSA520、TSA570、TSA620、TSA700、DAPI）和七色plus（TSA480、TSA520、TSA570、TSA620、TSA700、TSA770、DAPI），這幾個(gè)試劑盒里的染料之間是幾乎不會(huì)有串?dāng)_的情況。如染料TSA540跟TSA520、TSA570的熒光波長(zhǎng)挨得十分接近，TSA650和TSA620挨得很近，在做染料選擇的時(shí)候就要避開同時(shí)應(yīng)用，比如已經(jīng)用了TSA520，那在同一個(gè)項(xiàng)目中就不要用TSA540再進(jìn)行染色；如果無法避免必須要同時(shí)用，就需要掃描儀或者顯微鏡具有光譜拆分的功能，完成掃描以后再在工作站進(jìn)行通道的拆分優(yōu)化，但至于拆分的效果也取決于染色和成像的效果，所以為了得到一個(gè)不錯(cuò)的結(jié)果，可能需要實(shí)驗(yàn)者不斷地調(diào)試與優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的條件。

2、如果所使用的染料之間本身間隔較遠(yuǎn)，不存在光譜重疊度過高的情況，那出現(xiàn)這種信號(hào)的高度重疊，多半是因?yàn)榍耙惠喛贵w沒有洗脫干凈，且前一輪的一抗來源恰好跟后一輪相同，當(dāng)前一輪沒有洗干凈的時(shí)候，殘留的一抗也會(huì)跟后一輪的二抗結(jié)合，導(dǎo)致信號(hào)出現(xiàn)重疊。需要優(yōu)化洗脫的條件。修復(fù)液+高壓的條件基本都能洗脫得比較干凈，但因?yàn)闂l件較強(qiáng)，很容易出現(xiàn)組織從片子上脫落的情況；如果是選擇修復(fù)液+微波加熱的方式，那就需要優(yōu)化微波修復(fù)的條件，Absin實(shí)驗(yàn)室推薦可以采用先高火煮沸修復(fù)液，取出修復(fù)盒后快速插入待洗脫/修復(fù)的切片，蓋蓋子后繼續(xù)放入微波爐低火維持15min，如果最后洗脫效果不理想，可以延長(zhǎng)低火維持的時(shí)間，或者調(diào)整微波爐的功率，不同微波爐的火力和功率有區(qū)別，需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行更改；如果是選用Absin抗體洗脫液（abs994），則需要關(guān)注沒洗干凈的指標(biāo)是否是一些較難洗脫的蛋白，如結(jié)構(gòu)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、胞漿胞核蛋白，考慮需要延長(zhǎng)洗脫的時(shí)間或更換更強(qiáng)的洗脫方式（如熱修復(fù)），或者將難以洗干凈的蛋白放到最后順位去染色。

3、當(dāng)兩通道各自存在獨(dú)立信號(hào)，但出現(xiàn)大量非特異性共定位重疊信號(hào)：

① 如圖3所示，真正的共定位信號(hào)兩指標(biāo)熒光都很強(qiáng)，而非特異性的共定位信號(hào)一個(gè)指標(biāo)很強(qiáng)，另一個(gè)指標(biāo)很弱，較容易區(qū)分，在不調(diào)整實(shí)驗(yàn)的情況下，可以通過調(diào)整儀器的曝光時(shí)間來改善（如圖中在CD8通道出現(xiàn)了比較弱的CD3信號(hào)，減少CD8通道的曝光時(shí)間），因?yàn)樵介L(zhǎng)的曝光時(shí)間，越容易把背景和相近通道的信號(hào)曝光出來。

② 避免把會(huì)存在共表達(dá)的指標(biāo)搭配波長(zhǎng)相近染料，如CD3應(yīng)用了TSA570，則CD8避開使用TSA620，可以選用相距較遠(yuǎn)的TSA700或TSA520；另外在染色的時(shí)候，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，微調(diào)各指標(biāo)的染色條件，比如單標(biāo)染色發(fā)現(xiàn)CD3信號(hào)非常強(qiáng)，CD8相對(duì)CD3弱很多，在多染的時(shí)候染CD3可以再降低抗體濃度，縮短抗體孵育時(shí)間，以及染料孵育時(shí)間，或CD8增高抗體濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間，再搭配曝光時(shí)間的調(diào)整，也能有效避免信號(hào)串?dāng)_問題。

③ 如果儀器可以控制拍攝不同通道的順序，相鄰的通道也可以間隔開拍攝，因?yàn)闊晒庑盘?hào)被激發(fā)以后，在信號(hào)比較強(qiáng)的情況下，會(huì)在片子上留存一段時(shí)間，如果緊接著拍攝鄰近的通道，有可能這個(gè)鄰近通道也會(huì)接收到上一個(gè)通道的殘留信號(hào)，因此可以考慮間隔開拍攝。

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