主要用途

細(xì)胞膜流動性（fluidity）PDA 熒光檢測試劑是一種旨在通過苯并芘癸酸熒光染料，選擇性地與細(xì)胞膜整合，

并與之產(chǎn)生空間交互作用，形成激基締合物，其熒光散發(fā)波長的轉(zhuǎn)移，即熒光比值的增強或減弱，來分析

膜流動性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種人體或動物貼

壁或懸浮細(xì)胞膜流動性的動力學(xué)檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，活體檢測，操作簡易，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)微管以及微絲的動力學(xué)特征和微泡和囊泡內(nèi)脂質(zhì)的流動動力學(xué)，即流變學(xué)（rheological）細(xì)

胞功能，受到細(xì)胞膜流動性（fluidity）或粘性（viscosity）調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞膜酶系的活化，微管和微絲的特

定裝配或流動，化學(xué)引誘物受體親和力的強化，膜結(jié)構(gòu)和功能的作用等。一旦調(diào)節(jié)失衡，會導(dǎo)致病理演變

或膜性變異。苯并芘癸酸（pyrenedecanoic acid；PDA）為多環(huán)芳香烴（polycyclic aromatic hydrocarbon）化

合物，一種親脂性苯并芘熒光探針染料，用于膜生物物理學(xué)研究：第一，具有親脂性； 第二，與細(xì)胞膜脂

質(zhì)具有類似性（analog），可以與細(xì)胞膜整合；第三，進入膜結(jié)構(gòu)空間后，與之產(chǎn)生交互作用，形成激基締

合物（eximer），其熒光散發(fā)波長由372nm轉(zhuǎn)移到470nm，通過締合物和單體的熒光比值（ratio），分析膜流

動性強弱，包括動力學(xué)，影響因子等。

產(chǎn)品內(nèi)容

染色液（Reagent A）

微升

稀釋液（Reagent B）

毫升

清理液（Reagent C）

毫升

強化液（Reagent D）

微升

產(chǎn)品說明書

1 份

保存方式

保存清理液（Reagent C）在 4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent A）避免光照；有

效保證 6 月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細(xì)胞脫離操作

細(xì)胞培養(yǎng)液（12052）：用于細(xì)胞脫落操作

1.5 毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺式離心機：用于樣品操作

培養(yǎng)箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光定性分析

比色皿或黑色 96 孔板：用于熒光定量分析的容器熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光定量分析

細(xì)胞流式儀：用于熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent B）

和強化液（Reagent D）放進 25℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后分別移出 xx 微升染色液（Reagent A）和 xx 微升

強化液（Reagent D）到新的 1.5 毫升離心管，加入 980 微升稀釋液（Reagent B），混勻后，在冰槽里靜置

（共 5 次操作量），并標(biāo)記為染色工作液，放在暗室里。然后進行下列操作。

一、直接法

1． 準(zhǔn)備 1 個 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的待測細(xì)胞，每孔鋪滿率達(dá) 70％（約 1 X 10 5細(xì)胞數(shù)）

2． 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液

3． 輕輕沿著孔壁加入 xx 微升 清理液（Reagent C）到細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面

4． 小心抽去清理液（Reagent C）

5． 加入 xx 微升含有染色液（Reagent A）、稀釋液（Reagent B）和強化液（Reagent D）的染色工作液，

覆蓋培養(yǎng)孔表面

6． 放進 25℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里，孵育 20 分鐘（注意避光）

7． 小心抽去染色工作液

8． 小心加入 xx 微升清理液（Reagent C）

9． 小心抽去清理液（Reagent C）

10．重復(fù)實驗步驟 8 至 9 一次

11．小心加入 xx 微升清理液（Reagent C）

12．選擇下列檢測：

一、 即刻在倒置熒光顯微鏡下進行觀察

1） 單體熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長 350nm，散發(fā)波長 370nm，干涉濾波器 405nm 波長 ）――

可見淺藍(lán)色熒光；如果強度明顯，表明膜流動性減弱

2） 激基締合物（eximer）熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長 350nm，散發(fā)波長 470nm）――可見

深藍(lán)色熒光；如果強度顯著減弱，表明膜流動性減弱

二、即刻在熒光酶標(biāo)儀檢測（激發(fā)波長 350nm，散發(fā)波長 370nm 和 470nm）：獲得相對熒光單位

（relative fluorescence unit；RFU）以及 RFU470/RFU370 的比值：比值高，膜流動性強

二、間接法

1． 準(zhǔn)備 1 個 12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的待測細(xì)胞，每孔鋪滿率達(dá) 70％（約 2 X 10 6細(xì)胞數(shù)）

2． 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液

3． 加入 xx 毫升 清理液（Reagent C）到細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面

4． 小心抽去 xx 毫升 清理液（Reagent C）

5． 加入 500 微升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)孔表面

6． 置入 37℃培養(yǎng)箱 1 分種

7． 輕輕抖動培養(yǎng)板，使細(xì)胞脫落，然后加入 1 毫升用戶自備的細(xì)胞培養(yǎng)液

8． 移入 1.5 毫升離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步開始）

23

9． 放進微型臺式離心機離心 5 分鐘，速度為 1000g

10．小心抽去上清液

11．加入 xx 微升含有染色液（Reagent A）、稀釋液（Reagent B）和強化液（Reagent D）的染色工作液

12．用 200 微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細(xì)胞顆粒群

13．放進 25℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里，孵育 20 分鐘（注意避光）

14．放進微型臺式微型離心機離心 5 分鐘，速度為 1000g

15．小心抽去上清液

16．加入 xx 微升清理液（Reagent C），混勻細(xì)胞顆粒群

17．放進微型臺式微型離心機離心 5 分鐘，速度為 1000g

18．小心抽去上清液

19．重復(fù)實驗步驟 16 至 18 一次

20．加入 xx 微升清理液（Reagent C），混勻細(xì)胞顆粒群

21．進行下列檢測

選擇一、（共聚焦）熒光顯微鏡觀察

1． 混勻后，移出 50 微升在載玻片上

2． 即刻進行載玻片壓片，在熒光顯微鏡下進行觀察：

1） 單體熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長370nm，干涉濾波器405nm 波長 ）――

可見淺藍(lán)色熒光；如果強度明顯，表明膜流動性減弱

2）激基締合物（eximer）熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長 350nm，散發(fā)波長 470nm）――可見

深藍(lán)色熒光；如果強度顯著減弱，表明膜流動性減弱

選擇二、細(xì)胞流式儀分析

1. 混勻后，即刻進行細(xì)胞流式儀分析：觀察 5000 個細(xì)胞以上

激發(fā)波長

360nm

熒光顏色

藍(lán)色

散發(fā)波長

單體波長 400nm 和締合物波長 450nm

（70nm 波寬）

熒光變化

建立象限圖/散點圖

選擇三、熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀測定

1． 混勻后，移出 100 微升到黑色 96 孔板里或 100 微升比色皿里

2． 即刻進行熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀測定（激發(fā)波長 350nm，散發(fā)波長 370nm 和 470nm）：獲得相

對熒光單位（relative fluorescence unit；RFU）以及 RFU470/RFU370 的比值：比值高，膜流動性強

注意事項

1． 本產(chǎn)品為 20 次（0.2 毫升工作液）操作2． 操作時，須戴手套

3． 待測細(xì)胞建議不要過于饑餓或過度生長

4． 操作時，避免污染母液，尤其是稀釋液（Reagent B）

5． 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進行熒光檢測分析

6． 孵育時，避免光照

7． 本公司提供系列膜流動性檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰