動物模型是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中重要的實(shí)驗(yàn)方法與手段，有助于更方便、更有效地認(rèn)識人類疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和研究防治措施。動物活體成像技術(shù)主要分為光學(xué)成像、核素成像、核磁共振成像MRI、計(jì)算機(jī)斷層攝影CT成像和超聲成像五大類。其中可見光成像和核素成像特別適合研究分子、代謝和生理學(xué)事件，稱為功能成像；超聲成像和CT則適合于解剖學(xué)成像，稱為結(jié)構(gòu)成像，MRI介于兩者之間。

光學(xué)成像

可見光成像是小動物活體實(shí)驗(yàn)最常見的成像方式，包括生物發(fā)光與熒光兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶基因標(biāo)記DNA，利用其產(chǎn)生的蛋白酶與相應(yīng)底物發(fā)生生化反應(yīng)產(chǎn)生生物體內(nèi)的光信號。而熒光技術(shù)則采用熒光報告基因或熒光染料等新型納米標(biāo)記材料進(jìn)行標(biāo)記。前者是動物體內(nèi)的自發(fā)熒光，不需要激發(fā)光源，而后者則需要外界激發(fā)光源的激發(fā)。

今天帶大家一起來看一下小動物活體成像實(shí)驗(yàn)流程，主要分為三大部分：一，進(jìn)行光學(xué)標(biāo)記；二，構(gòu)建動物模型；三，活體動物成像

具體細(xì)分為：

1. 選擇合適的熒光素酶

2. 進(jìn)行載體構(gòu)建

3. 建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

4. 細(xì)胞注射動物

5. 注射底物

6. 進(jìn)行活體成像

1. 光學(xué)標(biāo)記

（1）質(zhì)粒的擴(kuò)增和純化

制備帶有熒光素luc轉(zhuǎn)酶報告基因或編碼熒光蛋白基因的真核表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行擴(kuò)增純化。

（2）細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的目標(biāo)細(xì)胞，將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%孔培養(yǎng)板中，即可轉(zhuǎn)染。進(jìn)行轉(zhuǎn)染時，將目標(biāo)細(xì)胞、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑及足量的質(zhì)粒載體懸浮液共培養(yǎng)6h，之后補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)液。也可采用Neucleofector電轉(zhuǎn)染的方式，能夠縮短轉(zhuǎn)染時間，獲取更高轉(zhuǎn)染效率的細(xì)胞。

（3）單克隆細(xì)胞篩選

轉(zhuǎn)染48h后用胰酶消化細(xì)胞，以1:6比例接種到6孔板中，同時加入抗生素G418，隨后每2d更換一次培養(yǎng)基并維持G418篩選直至單細(xì)胞抗性克隆的出現(xiàn)。分別挑選單一抗性克隆至96孔板，待其逐漸增殖后轉(zhuǎn)入24孔板中繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

（4）熒光素酶活性鑒定陽性克隆，篩選穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞株

單一抗性克隆傳代至第五代時用Luciferase Assay System檢測熒光素酶活性。檢測時，各克隆按1×10^5個/孔接種到24孔板，24h后細(xì)胞裂解液裂解，12000r，4℃離心10min，收集裂解物，取上清10μl加入96孔白板中，向每孔加入50μl熒光素酶連續(xù)讀底物，停留2s后，取10s的熒光值（RLU），每個克隆設(shè)3個復(fù)孔，保留RLU值高的細(xì)胞克隆繼續(xù)傳代培養(yǎng)，再過5代后進(jìn)行熒光素酶活性檢測。保留RLU值維持較高的克隆直至第30代，熒光素酶活性最高的幾個克隆MCF-7-luc即為陽性克隆。將篩選出高效表達(dá)，陽性率接近100%的細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)。

2.構(gòu)建動物模型

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇尾靜脈注射、皮下移植、原位移植等方法接種已標(biāo)記的細(xì)胞。

3.活體成像

（1）小鼠經(jīng)過麻醉系統(tǒng)被麻醉后放入成像暗箱平臺，軟件控制平臺的升降到一個合適的視野，自動開啟照明燈拍攝第一次背景圖。（為了降低光吸收，建議大家對成像小鼠做脫毛處理）

（2）自動關(guān)閉照明燈, 在沒有外界光源的條件下拍攝由小鼠體內(nèi)發(fā)出的光，即為生物發(fā)光成像。與第一次的背景圖疊加后可以清楚的顯示動物體內(nèi)光源的位置，完成成像操作。熒光成像應(yīng)選擇合適的激發(fā)和發(fā)射濾片，生物發(fā)光則需要成像前體內(nèi)注射底物激發(fā)發(fā)光。

（3）利用軟件完成圖像分析過程。使用者可以方便的選取感興趣的區(qū)域進(jìn)行測量和數(shù)據(jù)處理及保存工作。當(dāng)選定需要測量的區(qū)域后，軟件可以計(jì)算出此區(qū)域發(fā)出的光子數(shù)，獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

 IVIS Lumina III是Revvity推出的第三代小動物活體光學(xué)二維成像平臺。該系統(tǒng)秉承了前幾代IVIS系列共有的作為業(yè)內(nèi)金標(biāo)準(zhǔn)的高靈敏度生物發(fā)光二維成像性能，并且進(jìn)一步優(yōu)化了熒光二維成像性能，將濾光片標(biāo)準(zhǔn)配置數(shù)量增加至26個，同時引入了作為熒光多光譜成像金標(biāo)準(zhǔn)的純光譜分析技術(shù)（CPS），使得Lumina III成為同時擁有生物發(fā)光及熒光二維成像金標(biāo)準(zhǔn)的高性能活體成像平臺。

主要特點(diǎn)

•高靈敏度生物發(fā)光二維成像

•高性能熒光二維成像,配備高品質(zhì)濾光片光譜分離算法，可實(shí)現(xiàn)自發(fā)熒光扣除及多探針成像

•生物發(fā)光及熒光成像模式聯(lián)合使用

•基于切倫科夫輻射原理的放射性同位素成像