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高濃度胰島素試劑盒專門用于定量高濃度細(xì)胞上清液樣品中的胰島素，無(wú)需執(zhí)行稀釋步驟。
概述
在測(cè)定中對(duì)胰島素進(jìn)行定量之前，通常需要稀釋高度濃縮的樣品。該 HTRF 高范圍試劑盒無(wú)需清洗步驟，動(dòng)態(tài)范圍為 4 對(duì)數(shù)，可實(shí)現(xiàn)更低的樣品稀釋度和更高的準(zhǔn)確度，從而實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單可靠的胰島素定量。
測(cè)定原理:使用兩種單克隆抗體的夾心免疫測(cè)定法測(cè)量胰島素，一種用 Cryptate（供體）標(biāo)記，另一種用 XL665（受體）標(biāo)記。獲得的 FRET 信號(hào)強(qiáng)度與樣品中胰島素的濃度成正比。
檢測(cè)方案:5 µL 細(xì)胞上清液補(bǔ)充有 50 µL 受體標(biāo)記抗體和 25 µL 供體標(biāo)記抗體（或單個(gè)分液步驟中補(bǔ)充 75 µL 預(yù)混合試劑）。然后將混合物在室溫下孵育 4 小時(shí)至過夜，并在 HTRF 兼容讀取器上讀取結(jié)果。
HTRF 高范圍胰島素測(cè)定顯示與人胰島上清液中的 RIA 具有好的相關(guān)性。回歸線的斜率為 0.9，接近理想線，證明了測(cè)定的可靠性。
對(duì)小鼠和大鼠 B 細(xì)胞的驗(yàn)證:將 MIN6 小鼠 ?-細(xì)胞和 INS-1E 大鼠 ?-細(xì)胞接種到 24 孔板中（500 µL 培養(yǎng)基中，每孔 400,000 個(gè)細(xì)胞），然后在 37°C - 5% CO2 的全培養(yǎng)基中培養(yǎng) 6 天。刺激前，用 KRB 緩沖液洗滌細(xì)胞，并在 KRB 緩沖液（不含葡萄糖）中于 37°C 進(jìn)行細(xì)胞靜止步驟 2 小時(shí)。用 250 µL 含有濃度不斷增加的葡萄糖的 KRB 緩沖溶液刺激細(xì)胞。MIN6 細(xì)胞分泌 10 分鐘和 30 分鐘后，或 INS-1E 細(xì)胞分泌 2 小時(shí)后，收集細(xì)胞上清液*并使用 HTRF 檢測(cè)試劑對(duì)胰島素進(jìn)行定量。每個(gè)處理?xiàng)l件一式三份進(jìn)行測(cè)量（誤差線代表SEM）。
大鼠胰島驗(yàn)證:將雄性 Wistar 大鼠新鮮分離的胰島在含有 2.8 mM 葡萄糖（非刺激性基礎(chǔ)條件）或 8.3 mM 葡萄糖（刺激性條件）的 KRB 緩沖液中于 37°C 孵育 30 分鐘（5 個(gè)胰島/管；4 管/健康）狀況）。孵育期結(jié)束時(shí)，收集上清液*并使用胰島素高范圍試劑盒測(cè)定胰島素濃度。
* 樣品由法國(guó)蒙彼利埃大學(xué)糖尿病藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室、Max Mousseron 生物分子研究所 (IBMM)、CNRS UMR-5247 藥學(xué)院慷慨提供
對(duì)離體灌注大鼠胰腺的驗(yàn)證:用含有 1.5 g/L 葡萄糖 +/- 10 µM 槲皮素的 KRB 緩沖液灌注從雄性 Wistar 大鼠中分離的胰腺。向培養(yǎng)基中連續(xù)通入 95% O2 ± 5% CO2 并保持在 37.5°C。選擇恒定壓力以提供 2.5 至 3.3 mL/min 之間的流速。隨著時(shí)間的推移收集流出液*（13 個(gè)部分），并使用試劑盒試劑測(cè)量胰島素濃度。
* 樣品由法國(guó)蒙彼利埃大學(xué)糖尿病藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室、Max Mousseron 生物分子研究所 (IBMM)、CNRS UMR-5247 藥學(xué)院慷慨提供
對(duì)人類胰島的驗(yàn)證:將來(lái)自 3 個(gè)人胰腺（A、B 和 C）的胰島置于 24 孔板中（50 個(gè)胰島/孔，3 孔/條件），并在含有 2.8 mM 葡萄糖的 KRBH 緩沖液中于 37°C 預(yù)孵育 1 小時(shí)。孵育延長(zhǎng)一小時(shí)并收集上清液以測(cè)量基礎(chǔ)胰島素分泌。接下來(lái)用 16.7 mM 葡萄糖在 37°C 下刺激胰島 1 小時(shí)，然后收集上清液以測(cè)量葡萄糖刺激的胰島素分泌。然后用酸-乙醇溶液裂解胰島24小時(shí)，收集裂解物并離心。使用胰島素高范圍試劑盒試劑對(duì)上清液*和裂解物*中的胰島素進(jìn)行定量。
* 樣本是在法國(guó)蒙彼利埃大學(xué)醫(yī)院再生醫(yī)學(xué)和生物治療研究所 (IRMB) 糖尿病細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)室生成的。
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