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ASA抗精子抗體ELISA試劑盒
（德國IBL進口原裝，貨號：RE52001）
德國IBL中國*代理商“深圳科潤達生物工程有限公司”竭誠為您服務
用于人血清中抗精子表面抗原自身抗體體外定量檢測的酶免試劑盒。
1、說明
在西方國家，不孕夫婦的比例占總?cè)巳旱?0-15%（Haas et al，1980）。目前人們還不能的知道由免疫學因素導致不孕的發(fā)病率是多少。由于有很多不同的檢測方法，人們對抗精子抗體在不孕中的作用存在著很大爭議。在檢測抗精子抗體的傳統(tǒng)檢測方法中，精子凝集檢測和精子固定檢測已被廣泛應用。這些方法及其它凝集檢測都很耗費時間，并且結(jié)果與其操作不協(xié)調(diào)。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，用ELISA檢測抗精子抗體具有很多優(yōu)點。IBL公司的抗精子抗體ELISA試劑盒結(jié)合這些優(yōu)點，并同時還具有高靈敏度和高特異性的特點。此試劑盒操作簡單，并且可以檢測很多種血清。
注意：此實驗的附加信息可從IBL（
http://www.IBL-Hamburg.com）上獲取，或直接向漢堡IBL公司索取。
http://www.IBL-Hamburg.com）上獲取，或直接向漢堡IBL公司索取。2、實驗原理
IBL公司的精子抗體酶免試劑盒提供了人血清和精液中抗精子表面抗原抗體定量檢測所需要的實驗材料。
此檢測試劑盒利用的是非競爭性的原理。包被在包被板微孔中的精子表面抗原是從池子中提取到的，它采用的方法是Alexander在1984年所提及到的那種方法。將疑似免疫學不孕病人的血清（已稀釋好）加入到包被孔中溫育，之后洗板，再加入過氧酶標記的抗人免疫球蛋白（IgA，IgG和IgM）并溫育。溫育后洗板，再加入TMB底物液，并酶標儀檢測所顯示的顏色強度。微孔中所顯示的顏色強度與結(jié)合的免疫球蛋白濃度成正比。實驗結(jié)果可從標準曲線上讀取，結(jié)果單位為units/ml。
3、注意事項和預防措施：
1） 試劑僅供體外診斷和專業(yè)人士使用。
2） 試劑盒所中有害物質(zhì)的信息請見材料安全數(shù)據(jù)單。
3） 試劑盒中的所有試劑包括檢測過的人血清/血漿對HIV/II，HbsAg和HCV都表現(xiàn)為陰性，但是試劑中會出現(xiàn)此類病毒（HIV/II，HbsAg和HCV）或其他具有感染性的病原體的可能性都不能*被排除。因此，所有的試劑在使用和處理的過程中都應當作潛在生物有害物質(zhì)進行處理。
4） 請不要用嘴吹試劑，不要將試劑和樣品接觸皮膚和黏膜。
5） 樣本和試劑盒試劑處理場所，請勿吸煙、飲食和使用化妝品。
6） 處理樣品和試劑時請戴橡膠手套，微生物污染的試劑和樣品會導致錯誤的實驗結(jié)果。
7） 按照相應的國家生物安全管理條理*的方法處理樣品和試劑。
8） 請勿使用過期試劑
9） 按照說明書中所規(guī)定的體積（加樣體積和預處理步驟）進行實驗操作。使用校準的移液器時才可以得到理想的實驗結(jié)果。
10） 按照國家生物安全管理條理，實驗中的化學物質(zhì)和所使用或準備的試劑應當當作有害廢物處理。
11） 產(chǎn)品的材料安全數(shù)據(jù)能夠從IBL公司主頁上載可直接咨詢IBL公司獲取。安全數(shù)據(jù)單符合下列標準：EU-Guideline 91/155 EWG， ANSI-Standard，ISO-Sstandard 11014，OSHA（US）。
4、試劑盒組成
4.1試劑盒成分
試劑瓶上標出的量都是理論體積，所有的試劑瓶都裝滿了試劑。成分低于250μl的溶液，請注意：所有的溶液都在試劑瓶的底部。
4.1.1包被板，12×8孔，微孔中包被了精子表面抗原。
4.1.2標準品，3支，凍干粉，將每支凍干粉溶解于1ml的洗滌液中。重新配制好的標準品（標準品S5）100μl內(nèi)含500mU抗精子抗體。
4.1.3酶聯(lián)物，601倍濃縮，1支，100μl，內(nèi)含過氧酶標記的抗人IgG、IgA、IgM，使用前用稀釋液按1：601的比例進行稀釋。
4.1.4 TMB底物液，1瓶，10ml，即用，內(nèi)含TMB及穩(wěn)定劑。
4.1.5 TMB終止液，1瓶，10ml，即用，內(nèi)含1M的H2SO4，注意：避免皮膚接觸。
4.1.6洗滌液，20倍濃縮，1瓶，50ml，用雙蒸水按1：20的比例稀釋，配置好的洗滌液在2-8℃的環(huán)境下可穩(wěn)定存放4周。
4.1.7稀釋液，3瓶，凍干，每瓶用20ml洗滌液稀釋，配置好的稀釋液在2-8℃的環(huán)境下可穩(wěn)定存放2天，如果凍存于-20℃的環(huán)境下則可存放更長時間。
4.1.8質(zhì)控血清，3支，凍干，每支用1ml的洗滌液稀釋。質(zhì)控血清應在每次實驗時臨時配置，并且僅能使用一次。質(zhì)控血清的可接受范圍請見質(zhì)量質(zhì)控單。
4.1.9封板紙，5片
4.10實驗所需器材但試劑盒不提供
1）校準的精密移液器及取樣吸頭：0-20μl，10-100μl，100-1000μl
2）多道移液器，50-200μl
3）洗板機及洗滌瓶
4）37℃溫育器
5）帶450nm濾光片的酶標儀
4.2試劑盒的儲存與穩(wěn)定性
試劑盒應當2-8℃的環(huán)境下運輸。包被板條一但被拆開，應當將其重新密封好。拆開了板條儲存于2-8℃的環(huán)境下時，其免疫活性可穩(wěn)定6周。
4.3試劑的準備
實驗開始前將所需數(shù)目的板條和所有試劑都平衡到室溫。試劑盒可分3次進行檢測，下面所述體積可用來檢測4條包被板條（32個檢測孔）。如果實驗中需使用更多板條，則體積應當相應的進行改變。
4.3.1洗滌液，在30ml濃縮的洗滌液中加入600ml雙蒸水。
4.3.2稀釋液，在每支凍干的稀釋液中加入20ml即用型的洗滌液。
4.3.3標準品、質(zhì)控血清
a）S5（500mU/100μl），將每支標準品用1ml即用型的洗滌液進行稀釋。重新配制好的標準品（標準品S5）100μl內(nèi)含500mU抗精子抗體。
b）其它濃度的樣品可用稀釋液進行連續(xù)稀釋獲得，具體如下：
| S5 500mU/100μl S4 250mU/100μl= 500μl S5 + 500μl稀釋液 S3 125mU/100μl= 500μl S4 + 500μl稀釋液 S3 62.5mU/100μl= 500μl S3 + 500μl稀釋液 S2 31.3mU/100μl= 500μl S2 + 500μl稀釋液 S0 0 mU/100μl= 500μl稀釋液（零標準品） |
c）質(zhì)控血清，在每支凍干的質(zhì)控血清中加入1ml即用型的洗滌液。
4.3.4酶聯(lián)物，在15μl濃縮的酶聯(lián)物中加入9ml稀釋液，混合均勻。
4.4準備好試劑的儲存與穩(wěn)定性
4.4.1配置好的洗滌液在2-8℃的環(huán)境下可穩(wěn)定存放4周。冷藏時溶液會出現(xiàn)磷酸鹽沉淀物，室溫下又會溶解。
4.4.2樣品稀釋液，配置好的稀釋液在2-8℃的環(huán)境下可穩(wěn)定存放2天，如果凍存于-20℃的環(huán)境下則可存放更長時間。
4.4.3標準品、質(zhì)控品，應在每次實驗時臨時配置，并且僅能使用一次。
4.4.4酶聯(lián)物，配置好的酶聯(lián)物可在室溫下穩(wěn)定存放20min。
4.5試劑盒的處理
按照國家*條理處理試劑盒，具體信息請見產(chǎn)品的材料安全數(shù)據(jù)單。
4.6破損試劑盒的處理
如果試劑盒有破壞的請與IBL公司或是提交您的投訴單，但自您拿到試劑盒后zui遲不超過一個星期。嚴重破損的成分不能用于實驗，將其保存好直至找到zui終的解決辦法。之后，按照*條例將其處理掉。
5、樣品
5.1采集
血清：按照一般原則進行靜脈采血。不要使用明顯溶血、黃疸血和脂血樣品。
精液：精液樣品應當用1000的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，之后用上清做實驗（精液）。
5.2儲存
血清、精液：采集的樣品存放于2-8℃的環(huán)境下時，必須在24小時內(nèi)將其檢測掉。如果想將血清存放更長時間，可以將血清凍存于-20℃的環(huán)境下，避免反復凍融。
5.3預處理
血清、精液：用稀釋液將病人樣品按1：51的比例進行稀釋（例如：10μl樣品+500μl稀釋液），混合均勻。
6、實驗步驟
一般注意事項：實驗開始前，應當將所有的試劑和樣品都平衡到室溫。所有試劑混合時都應避免泡沫產(chǎn)生。為了避免交叉反應，每份試劑、標準品和樣品都應使用新的取樣吸頭。在實驗開始前，我們建議您將所有的試劑都準備好，將蓋子移去，將所需數(shù)目的板條置于板架上等。這些準備工作可保證每一加樣步驟間的時間間隔相同并且無中斷。將所需數(shù)量的板條固定到板架上準備加樣。
6.1實驗步驟
6.1.1加100μl標準品、質(zhì)控品和樣本于相應反應孔中
6.1.2封板后37℃溫育60分鐘。
6.1.3每孔用300μl洗滌液洗板3次（建議您使用洗板機），吸水紙上拍干。注意：洗板步驟是否操作正確會明顯影響實驗的靈敏度和精密度。
6.1.4在每一微孔中加入100μl酶聯(lián)物。
6.1.5封板后37℃溫育60分鐘。
6.1.6每孔用300μl洗滌液洗板3次
6.1.7在每一微孔加TMB底物液100μl。
6.1.8室溫（18℃-24℃）溫育10-15分鐘。
6.1.9每孔加50μl終止液以終止底物反應，輕輕振板以使溶液混合均勻。
6.1.10加終止液后30min內(nèi)在450nm讀取OD值。（參考波長：600-650nm）
6.2結(jié)果計算
標準品、質(zhì)控品和病人樣本結(jié)果的計算：
在雙對數(shù)坐標紙上，以標準品的OD值對標準品濃度作一條標準曲線。用標準曲線計算未知樣品（已稀釋）總的抗精子抗體濃度（mIU/100μl）。zui后將結(jié)果乘以0.5便得到未稀釋樣品的濃度（U/ml）。
| U/ml=Mu/100μl × |
| = mU/100μl×0.5 |
1000（mU變成U的轉(zhuǎn)換系數(shù)）
自動計算：
用三次回歸、四參數(shù)或雙對數(shù)方程做標準曲線圖一般都可以獲得較好的效果。至于結(jié)果的準確度請件第7項（實驗特性）。樣品中抗體濃度高于zui高標準品的應當用相應的稀釋液稀釋并重新檢測。zui后將結(jié)果乘以相應的稀釋因子即可。
下面是抗精子抗體ELISA試劑盒標準曲線的一個典型范例：
| 樣品 | OD值 |
| |
| S0 | 0.057 | 0.00 | |
| S1 S2 S3 | 0.264 | 31.3 | |
| 0.484 | 62.5 | ||
| 0.886 | 125 | ||
| S4 | 1.353 | 250 | |
| S5 | 2.170 | 500 |
6.3自動檢測
IBL公司的實驗室以證明：抗精子抗體ELISA試劑盒可用全自動酶免分析儀來做。操作說明可直接向IBL索取或從IBL公司的主頁上下載。具體信息請將“自動檢測”項。
7、實驗特性
7.1期望值
建議每個實驗室都確定自己實驗室的正常值范圍。在正常范圍的研究中，所有參與研究的人群都是明顯健康的個體，正常值的范圍的個體應當在95%上。
正常范圍（血清、精液）：＜150mU/100μl，相應的在未稀釋樣品中范圍為：＜75U/ml。
7.2特異性
包被板的微孔中包被了純化的精子特異性抗原。目前沒有發(fā)現(xiàn)它與其它抗體間有交叉反應。
7.3靈敏度
此試劑盒可檢測到的zui低濃度為0.14mU/100μl（等于零標準品OD值的平均值減去兩倍的標準差），在未稀釋的樣品中對應為0.07U/ml。
7.4精密度
7.4.1板內(nèi)差異
在實驗中，用五中不同的質(zhì)控血清做雙份檢測來確定板內(nèi)差異。板內(nèi)差異實驗結(jié)果如下：
| 樣品 | 數(shù)量 | 平均值（mU/100μl） | 標準差（mU/100μl） | CV（%） |
| 1 | 15 | 47.0 | 2.0 | 4.3 |
| 2 | 15 | 64.0 | 7.6 | 11.9 |
| 3 | 15 | 98.0 | 2.6 | 2.7 |
| 4 | 15 | 59.0 | 4.5 | 7.6 |
| 5 | 15 | 151.0 | 11.8 | 7.8 |
7.4.2板間差異
在實驗中，用五中不同的質(zhì)控血清做雙份檢測來確定板間差異。板間差異實驗結(jié)果如下：
| 樣品 | 數(shù)量 | 平均值（mU/100μl） | 標準差（mU/100μl） | CV（%） |
| 1 | 15 | 42.0 | 3.3 | 7.9 |
| 2 | 15 | 48.0 | 7.4 | 15.4 |
| 3 | 15 | 77.0 | 7.7 | 10.1 |
| 4 | 15 | 74.0 | 7.2 | 9.7 |
| 5 | 15 | 130.0 | 17.6 | 13.6 |
7.5準確性
7.5.1線形度
用稀釋液稀釋血清樣品以得到八份精子抗體濃度不同的血清樣品，再用ELISA試劑盒檢測已釋樣品中精子抗體的濃度。對三份樣品都進行了稀釋,結(jié)果如下:
| 樣品 | P1（mU/100μl） | 重現(xiàn)性（%） | P2（mU/100μl） | 重現(xiàn)性（%） | P3（mU/100μl） | 重現(xiàn)性（%） |
| 1:1 | 205.1 | 100 | 241.5 | 100 | 259.4 | 100 |
| 1:2 | 100 | 98 | 132.8 | 110 | 138.6 | 107 |
| 1:4 | 50.8 | 99 | 64.0 | 106 | 68.0 | 105 |
| 1:8 | 32.7 | 128 | 32.0 | 106 | 35.4 | 109 |
| 樣品 | P4（mU/100l） | 重現(xiàn)性（%） | P5（mU/100μl） | 重現(xiàn)性（%） | P6（mU/100μl） | 重現(xiàn)性（%） |
| 1:1 | 272.8 | 100 | 242.2 | 100 | 366.5 | 100 |
| 1:2 | 141.4 | 104 | 116.0 | 96 | 163.3 | 89 |
| 1:4 | 61.9 | 91 | 57.7 | 95 | 64.9 | 71 |
| 1:8 | 31.4 | 92 | 33.2 | 110 | 33.8 | 74 |
| 樣品 | P7（mU/100μl） | 重現(xiàn)性（%） | P8（mU/100μl） | 重現(xiàn)性（%） |
| 1:1 | 376.9 | 100 | 331.0 | 100 |
| 1:2 | 171.9 | 91 | 139.4 | 84 |
| 1:4 | 83.0 | 88 | 82.1 | 99 |
| 1:8 | 49.0 | 104 | 42.9 | 104 |
7.5.2重現(xiàn)性
用已知濃度的樣品濃縮四份血清樣品以提高精子抗體的濃度（所有結(jié)果單位都為mU/100μl）.
| 樣品 | 內(nèi)源性抗體濃度（mU/100μl） | 加入樣品的濃度（mU/100μl） | 期望值（mU/100μl） | 測的值（mU/100μl） | 重現(xiàn)性（%） |
| 1 | 52.0 | 346.0 | 398.0 | 307.0 | 77 |
| | 52.0 | 169.0 | 221.0 | 175.0 | 79 |
| | 52.0 | 68.0 | 120.0 | 116.0 | 97 |
| | 52.0 | 35.0 | 87.0 | 80.0 | 92 |
| | 52.0 | 16.0 | 68.0 | 69.0 | 101 |
| 2 | 76.0 | 346.0 | 422.0 | 329.0 | 78 |
| | 76.0 | 169.0 | 245.0 | 236.0 | 96 |
| | 76.0 | 68.0 | 144.0 | 140.0 | 97 |
| | 76.0 | 35.0 | 111.0 | 108.0 | 97 |
| | 76.0 | 16.0 | 92.0 | 91.0 | 99 |
| 3 | 79.0 | 326.0 | 405.0 | 354.0 | 87 |
| | 79.0 | 163.0 | 242.0 | 198.0 | 82 |
| | 79.0 | 72.5 | 151.5 | 136.0 | 90 |
| | 79.0 | 34.5 | 113.5 | 112.0 | 99 |
| | 79.0 | 17.5 | 96.5 | 89.0 | 92 |
| 4 | 120.0 | 319.0 | 439.0 | 356.0 | 81 |
| | 120.0 | 159.5 | 279.5 | 231.0 | 83 |
| | 120.0 | 69.5 | 189.5 | 180.0 | 95 |
| | 120.0 | 34.0 | 154.0 | 149.0 | 97 |
| | 120.0 | 18.0 | 138.0 | 130.0 | 94 |
7.5.3方法比較
IBL抗精子抗體ELISA試劑盒與ELIAS抗精子抗體ELISA試劑盒進行比較
IBL抗精子抗體ELISA試劑盒與市場上可買到的抗精子抗體ELISA試劑盒同時檢測38份病人樣品.線形回歸結(jié)果統(tǒng)計如下:
IBL ELISA=4.0698×ELIAS ELISA+1.0441;相關(guān)系數(shù)=0.869;數(shù)量=38
7.5.4質(zhì)量控制
根據(jù)國家規(guī)定，我們建議您用質(zhì)控品。使用質(zhì)控品可以保證結(jié)果的逐日有效性，正常的和病理水平的質(zhì)控都必須使用。質(zhì)控實驗室的質(zhì)控品及相應的結(jié)果記述在試劑盒的IBL的質(zhì)控單上。質(zhì)控單上的數(shù)據(jù)及范圍通常都與相應的批次對應，而且可直接用于結(jié)果比較。為了保證結(jié)果的準確性，建議使用國家或質(zhì)量評估程序。采用合適的統(tǒng)計方法分析質(zhì)控值。如果檢測結(jié)果不在質(zhì)控材料已確定的可接受范圍內(nèi)，則病人的結(jié)果視為無效。在這種情況下，請檢查下列技術(shù)區(qū)：加樣及記時設備；酶標儀；試劑有效期；儲存及溫育條件；抽吸及洗板方式。如果檢查了上述設備并且沒有發(fā)現(xiàn)任何問題，請直接IBL公司的代理商。
8、實驗的局限性
8.1干擾物質(zhì)
樣品處理不當或改變實驗程序都可能影響實驗結(jié)果。樣品處理不當對實驗所產(chǎn)生的影響請見“樣品采集”。疊氮鈉和硫柳汞濃度高于0.1%都會影響此實驗。因此，上述成分在質(zhì)控血清或樣品中濃度高于所述濃度時都可能會導致錯誤的實驗結(jié)果。
8.2高劑量鉤狀效應
在抗精子抗體ELISA試劑盒中沒有發(fā)現(xiàn)高劑量鉤狀效應。
9、法律方面
9.1結(jié)果的可靠性
實驗必須嚴格按照生產(chǎn)產(chǎn)家的說明書進行操作。另外，實驗者必須嚴格遵守實驗室優(yōu)化管理規(guī)則或其它可應用的國家標準或法律。這與質(zhì)控試劑的使用有很大的相關(guān)性。為了確保實驗的準確度和性，每個實驗都必須包含有足夠數(shù)量的質(zhì)控品。如果所有的質(zhì)控品都在特定的范圍內(nèi)，其他所有檢測參數(shù)也在所給的檢測范圍呢，實驗結(jié)果才有效。如有任何疑問請IBL公司。
9.2投訴
至于在投訴單（使用產(chǎn)家的投訴單）以書面形式上交時才才能受理，而且投訴單內(nèi)必須包含試劑盒的所有信息及實驗結(jié)果。投訴單的格式可以向IBL索取。
9.3治療方法
即使所有實驗結(jié)果都與9.1項所述要求相吻合，治療方法也不能根據(jù)實驗結(jié)果做出論斷。任何實驗結(jié)果都只是病人臨床癥狀的一部分。只有當實驗結(jié)果與病人所有的臨床癥狀一致時，我們才可以根據(jù)實驗結(jié)果確定治療方法。實驗結(jié)果本身就從來不能作為確定治療方法的*因素。
9.4責任性
對試劑盒做任何修改、交換或混合不同批次的試劑盒成分都會對預期結(jié)果和所有實驗結(jié)果的有效性產(chǎn)生負面影響。對試劑盒做了這種修改和交換都不能要求供貨商再包換。如果客戶理解錯誤實驗結(jié)果而投訴，則視為無效。不管是任何形式的投宿，生產(chǎn)商所負的責任都不會超過試劑盒本身的價格。試劑盒在運輸過程中所造成的破壞生產(chǎn)商都不負責任。
10、參考文獻
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