煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotidephosphate，簡稱NADP）與NAD的不同之處只在于其分子有一個額外的磷酸基，NADPH是它的還原形式。NADP+參與生物合成反應，如脂質(zhì)和核酸的合成。在動物細胞中，戊糖磷酸途徑的氧化階段是NADPH的極重要來源。NADP/NADPH的定量測定在細胞或組織的能量轉(zhuǎn)化和氧化還原狀態(tài)的研究中具有重要應用價值。

艾美捷 NADP/NADPH 檢測試劑盒（熒光法）：

目錄代碼：BA0107

包裝尺寸：100assays

僅供研究使用

NADP/NADPH 檢測試劑盒應用程序

直接測定：細胞或組織提取物中NADP’/NADPH的濃度和比率。

NADP/NADPH 檢測試劑盒主要功能：

1、靈敏準確。96孔板法檢測限為0.01μM，線性高達1μM NADP+/NADPH。實用的該程序包括添加一種工作試劑，并在時間0和30讀取熒光

Zui低室溫測定。

2、高吞吐量?？勺鳛槊刻鞌?shù)千個樣品的高通量96孔板法容易地自動化。

儲存條件：這套裝備是用冰塊裝運的。將所有試劑儲存在20°C的溫度下。保質(zhì)期：收到后6個月。

注意事項：試劑僅供研究使用。使用試劑時，應采取實驗室試劑的常規(guī)預防措施。有關詳細信息，請參閱材料安全數(shù)據(jù)表。

一般注意事項：

1.在這些濃度下，NADP’和NADPH的標準曲線是相同的。由于溶液中的NADPH不穩(wěn)定，我們只提供NADP作為標準。

2.該測定基于酶催化的動力學反應。工作試劑的添加應迅速，混合應簡短但徹-底。建議使用多通道移液器。

3.以下物質(zhì)會干擾樣品制備，應避免使用。EDTA（>0.5 mM）、抗壞血酸、SDS（>0.2%）、疊-氮-化-鈉、NP-40（>1%）和Tween-20（+1%）。

程序

1.樣品制備。對于每個樣品重量約為20 mg的組織，用冷PBS清洗。對于細胞樣品，用冷PBS洗滌細胞，每個樣品用約105個細胞沉淀。將樣品（組織或細胞）在1.5 mL Eppendorftube中用100μL NADP提取緩沖液（用于NADP測定）或100μL NADPH提取緩沖液均勻化（用于NADPH測定）。將提取物在60°C下加熱5分鐘，然后加入20μL測定緩沖液和100μL反向提取緩沖液以中和提取物。短暫渦旋并以14000rpm旋轉(zhuǎn)樣品5分鐘。使用上清液進行NADP’/NADPH測定。NADP+和NADPH濃度的測定需要從兩個單獨的樣品中提取。

2.校準曲線。準備500mL 1µM NADP+預混物，混合5mL 1mM標準和4995mL蒸餾水。稀釋標準品如下：

3.樣品。在單獨的孔中，每孔添加50μL樣品。

4.試劑制備。對于每個反應井，通過混合40μL測定緩沖液、1μL酶A、1μL-酶B、10μL葡萄糖和5μL探針來制備工作試劑。建議重新配制。

5.反應。每孔快速加入50μL工作試劑。輕敲盤子攪拌。

6.在室溫下孵育30分鐘后，在λev/em=530/585 nm下讀取時間“零”（Fo）和F3o的熒光。在培養(yǎng)過程中，請保護培養(yǎng)板免受光照。

文獻參考：

1.Zhao, Z, Hu, X and Ross CW (1987). Comparison of Tissue Preparation Methods for Assay of Nicotinamide Coenzymes.Plant Physiol.84:987-988.

2.Matsumura, H. and Miyachi S (1980). Cycling assay for nicotinamide adenine dinucleotides. Methods Enzymol. 69:

465-470.

3. Vilcheze, C et al.(2005). Altered NADH/NAD+ Ratio Mediates Coresistance to lsoniazid and Ethionamide inMycobacteria. Antimicrobial Agents and Chemotherapy.49(2): 708-720.