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適配子（Aptamer）是對某個(gè)靶點(diǎn)分子有特異結(jié)合的DNA或RNA寡核苷酸，因其分子識別能力在診斷和治療應(yīng)用中具有巨大的潛力。然而，高親和力和高特異性的核酸適配子往往不容易獲得。適配子一般是通過SELEX方法從核酸庫中進(jìn)行篩選，這個(gè)方法依賴于將靶點(diǎn)分子固定在某個(gè)固相，再去釣取潛在與靶點(diǎn)結(jié)合的適配子，但是固化有可能導(dǎo)致的空間位阻限制了靶點(diǎn)和適配子結(jié)合的自由度。
背景與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
近期的一篇文章中，四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黃震組先將靶點(diǎn)生物素化，然后將生物素靶點(diǎn)（HPV L1蛋白）和適配子在液相中混合形成適配子-靶點(diǎn)復(fù)合物，再用偶聯(lián)鏈霉親和素的固相介質(zhì)（包括磁珠和Octet® 傳感器）去抓取這種復(fù)合物，并進(jìn)行洗脫鑒定，這樣便成功克服了先固化靶點(diǎn)所帶來的不利影響，使得適配體的篩選效率顯著提升，該方法被稱之為 Free Aptamer-ligand Interaction (FRARI)[1]。
圖1. FRARI示意圖：通過多輪FRARI循環(huán)，富集和篩選到高親和力的適配子
本篇文章在篩選適配子過程中做了2個(gè)不同維度的比較：
1
SELEX, Octet® (BLI法，生物層干涉), 和MB (磁珠法)三種方法的比較；
2
隨機(jī)生物素化靶點(diǎn)和定點(diǎn)生物素化靶點(diǎn)的比較：前者通過靶點(diǎn)蛋白的氨基隨機(jī)共價(jià)偶聯(lián)生物素，后者通過Avi tag在N端進(jìn)行定點(diǎn)生物素化，原則上后者可以更好地保持靶點(diǎn)的天然結(jié)構(gòu)。
Octet® 的實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果
將生物素化靶點(diǎn)和DNA文庫室溫下孵育1小時(shí)。然后，使用Octet® 的SA傳感器與混合物孵育50分鐘來捕獲形成的復(fù)合物。用PBS洗滌兩次（一次600秒，一次120秒）后，將捕獲的復(fù)合物傳感器用蛋白酶K（1.8μL，20mg/mL）52°C中消化2小時(shí)。接下來，擴(kuò)增、制備次輪文庫，進(jìn)行多輪篩選后測序鑒定。
a
c
b
圖2. SELEX, MB, Octet® 三種方法比較（定點(diǎn)生物素化法）：SELEX 九輪富集的特異適配子豐度（a）遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于FRARI方法，包括BLI（b）和MB（c）
對比發(fā)現(xiàn)，Octet® 法和MB法在進(jìn)行6輪篩選后便能富集獲得特異性適配子，而在經(jīng)過9輪篩選后，Octet® 法和MB法均實(shí)現(xiàn)了高豐度的特異性適配子富集。并且基于FRARI的Octet® 法篩選出的幾個(gè)高親和力適配子與基于MB法篩選的結(jié)果是一致的。更關(guān)鍵的是，Octet® 法豐度的區(qū)分度更好，比如最高豐度的一個(gè)適配子（藍(lán)色）占絕大多數(shù)，隨后的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)該適配子具有更強(qiáng)的親和力，說明Octet® 可以更好地區(qū)分特異性適配子的親和力。
方法驗(yàn)證
Octet® 篩選出的豐度較好的適配子（S4）親和力是否更強(qiáng)呢？作者將生物素化的適配子固化在鏈霉親和素（SA）傳感器上，與靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行結(jié)合解離，以計(jì)算結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
圖3. Octet® 法篩選出的適配子與靶點(diǎn)親和力，可見S4的親和力最高，KD值達(dá)到幾十nM
隨后作者使用Octet® 法篩選的適配子成功建立了基于夾心法的HPV臨床診斷方法，實(shí)現(xiàn)了臨床樣品中HPV的檢測，進(jìn)一步證明這些適配子的強(qiáng)親和力和特異性。
Octet® 傳感器不僅適合FRARI法，而且相對MB法，Octet® 可以排除許多低親和力適配子，這可能是因?yàn)锽LI傳感器具有較少的表面積和非特異性結(jié)合。因此，Octet® 為核酸適配體的選擇提供了高效率的篩選方法。
最近廣西大學(xué)發(fā)表的一篇文章中，開發(fā)了一種便攜式、獨(dú)立的核酸適配子傳感器用于檢測蝗蟲信息素4-乙烯基苯甲醚（4VA），以監(jiān)測蝗蟲種群動(dòng)態(tài)，實(shí)現(xiàn)蝗災(zāi)預(yù)警。使用Octet® 的垂釣方法獲得了針對4VA的KD值為269.25±90.65nM的高親和力適配子，并用此來建立傳感器檢測方法。
圖4. 使用Octet® 傳感器固化4-乙烯基苯甲醚（4VA），結(jié)合適配子庫，然后用不同強(qiáng)度方法洗脫與4VA結(jié)合的適配子
表1. Octet® 篩選的適配子用Octet®進(jìn)行親和力測定
Octet® 不僅可以用于垂釣，也可以用于親和力的驗(yàn)證哦！
Octet® 用于親和力驗(yàn)證的優(yōu)點(diǎn)在于：
非標(biāo)記Direct Binding是趨勢，不需要標(biāo)記和信號放大，可以更好地保持反應(yīng)物的活性
快速測定親和力，提供結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)更加定量化地表征分子互作
無洗滌步驟，可測弱親和力（解離快）
寫入了美國藥典，文章多，認(rèn)可度廣
萬金油技術(shù)，可以用與檢測DNA，小分子，蛋白質(zhì)等各種生物分子
操作簡便，耗材及維護(hù)成本低
大家大膽地使用垂釣神器 Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)去發(fā)現(xiàn)未知世界吧！
《生物層干涉技術(shù)應(yīng)用文集第三版》
全新改版！
下載文檔
下載《生物層干涉技術(shù)應(yīng)用文集（第三版）》，查看更多更全面的BLI技術(shù)原理、應(yīng)用展示
-參考文獻(xiàn)-
【1】Highly-efficient selection of aptamers for detecting various HPV subtypes in clinical samples.Talanta 2023.
【2】Development of functional nucleic acid sensor for detection of locust pheromone 4-vinylanisole.Chemical Engineering Journal 466 (2023) 143065
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