免疫組化技術(shù)是利用已知的特異性抗體或抗原能特異性結(jié)合的特點，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記于結(jié)合后的特異性抗體上的顯示劑通過借助顯微鏡的觀察，從而在抗原抗體結(jié)合部位確定組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的一門組化技術(shù)。那么影響免疫組化實驗結(jié)果的因素有哪些呢？讓我們一起來看看吧！

一、組織的固定

組織固定的好壞直接影響免疫組化的結(jié)果，選擇良好的固定液并及時充分的固定可以防止組織自溶，最大限度保留組織的抗原性，保證免疫組化結(jié)果的準(zhǔn)確性。

常用固定液：

10%的中性緩沖福爾馬林（40%甲醛10ml+0.01mol/LPBS90ml(pH7.4)），一般固定液的量為組織塊體積的4~10倍，固定時間（常溫條件下固定8~24h）。

二、組織的脫水

組織脫水不che底，會出現(xiàn)組織掉片的現(xiàn)象，而且顯色效果差，容易混淆診斷。

為保證組織脫水che底，應(yīng)制定相應(yīng)的更換試劑的制度，及時更換并有專人負(fù)責(zé)，做好相應(yīng)的記錄。

三、切片

玻片選擇粘附載玻片，切片不宜厚，推薦厚度3~5μm，可以保證后續(xù)修復(fù)時最大限度暴露抗原。切片無皺褶、無氣泡，烤片溫度設(shè)置65~68℃，時間為3小時。烤片不充分會導(dǎo)致組織脫片影響后續(xù)的檢測，但烤片也不宜過度，溫度過高會加速抗原氧化，導(dǎo)致抗原丟失。

四、阻斷內(nèi)源酶

進行免疫組化標(biāo)記的組織，通常含有一定量的內(nèi)源性酶，由于在免疫組化染色過程中，大部分抗體是用過氧化物酶來標(biāo)記的。

比如我們通常使用HRP即辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，酶起催化作用，促進底物的結(jié)合，而組織中的內(nèi)源性酶同樣也能催化底物，這就影響了免疫組化的特異性。所以在加酶標(biāo)二抗之前，應(yīng)先用過氧化氫阻斷內(nèi)源酶，將對后續(xù)檢測結(jié)果的影響降到zui低。

五、抗體的選擇和使用

選用與使用的一抗同源性的二抗。要選擇適宜的一抗，不同的二抗與一抗?jié)舛炔黄ヅ?，都不能得到滿意的結(jié)果。

在滴加一抗、二抗時要先輕輕傾去PBS液，選用韌性好、吸水性強的紙巾吸干組織周圍液體，輕壓組織面吸干組織表面水分(不能滑動)，防止試劑被稀釋或致濃度不均，立即滴加適量試劑，用細(xì)玻棒將試劑擴展至組織外1～2mm，防止出現(xiàn)邊緣效應(yīng)，不能觸碰組織，液面厚約1mm為宜。

一抗孵育溫度一般設(shè)置37℃1小時或者4℃冰箱孵育過夜，二抗室溫孵育30-60min。為保證實驗結(jié)果的可靠性，推薦在實驗中設(shè)置同片的陽性對照和陰性對照。

試劑表面的氣泡用玻棒點破，否則氣泡張力作用會導(dǎo)致局部無試劑，出現(xiàn)氣泡下假陰性反應(yīng)。

六、顯色反應(yīng)

DAB顯色劑須現(xiàn)配現(xiàn)用，切片多時應(yīng)分次配制，分批顯色。根據(jù)溫度和整體顯色情況決定終止反應(yīng)，一般顯色時間3～5min，時間過長致顯色過深和背景著色，過短致反應(yīng)不足或出現(xiàn)假陰性。

由于DAB有一定的毒性，在操作時要特別注意自身的防護，實驗器材專用，以防污染。

七、試劑的保存

因為抗體是蛋白質(zhì)，保存或使用不當(dāng)不但會造成浪費，而且變質(zhì)會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

要注意抗體的有效期，對于一次用不完的抗體可保存在冰箱內(nèi)，而不要放在冷凍室，反復(fù)凍融，抗體效價會急劇下降而失效。

同時防止抗體的相互交叉污染和細(xì)菌污染。

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