細胞ADP/ATP比值生物發(fā)光法檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

  細胞ADP/ATP比值生物發(fā)光法檢測試劑是一種旨在通過螢火蟲熒光素酶反應(yīng)系統(tǒng)，熒光素在酶的催化下，與ATP發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生生物光能，采用冷光儀測定其相對冷光單位的變化，來定量分析丙酮酸激酶處理前后獲得的細胞樣品（包括裂解或懸液）中ADP/ATP比值的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞（動物、人體）的ADP/ATP比值（ratio）檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

技術(shù)背景

腺嘌呤核苷酸（adenine nucleotides），簡稱腺苷，包括單磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷，是一種單體單位，為核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）的組成成分，并提供化學(xué)能量，在能量代謝通路中維護諸如肌肉、胞膜等組織細胞結(jié)構(gòu)的生化和生理功能，調(diào)節(jié)細胞糖酵解、三羧酸循環(huán)、電子傳遞系統(tǒng)、氧化磷酸化活動。腺嘌呤核苷酸在細胞中濃度低，且不穩(wěn)定，通常通過其類型不同、濃度差異、分布狀況，來評價細胞的代謝情況和能量狀態(tài)。二磷酸腺苷（adenosine diphosphate；ADP），參與ADP-ATP循環(huán)，提供熱能轉(zhuǎn)換和動態(tài)平衡，尤其在線粒體需氧呼吸、光合成等實現(xiàn)。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate；ATP）存在于所有代謝活躍的細胞內(nèi)，是細胞活力的標志。一旦細胞凋亡或壞死，ATP濃度急遽下降。ADP/ATP比值（ADP/ATP ratio）常用于區(qū)分細胞死亡與存活的方式：繁殖、凋亡、壞死。在細胞活力和藥物發(fā)現(xiàn)研究中廣泛運用。螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）是62 kd 的單體蛋白，催化ATP依賴性熒光素（luciferin）的氧化，經(jīng)過電子轉(zhuǎn)移，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為氧化型熒光素（oxyluciferin）的光能，與ATP量成線性正相關(guān)。首先通過生物發(fā)光儀（560nm）檢測，定量ATP濃度，而后在丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）的存在下，將ADP轉(zhuǎn)化為ATP后，再次通過生物發(fā)光儀檢測，以定量ADP濃度，最終獲得ADP/ATP比值。其反應(yīng)方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

  清理液（Reagent A）         毫升

  裂解液（Reagent B）         毫升

  緩沖液（Reagent C）         毫升

  反應(yīng)液（Reagent D）         微升

  轉(zhuǎn)化液（Reagent E）          微升

產(chǎn)品說明書               1份

保存方式

保存  清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證3月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

黑色96孔板：用于冷光檢測操作的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

冷光儀：用于樣品冷光檢測

實驗步驟

一、 待測樣品準備

1． 準備好25cm²細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 10⁶細胞）

2． 小心抽去培養(yǎng)液（注意：如果檢測細胞培養(yǎng)上清的ATP活性，則可以收集后按照下述活性測定步驟直接檢測）

3． 小心加入xx毫升  清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

4． 小心抽去清理液

5． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）

6． 加入xx毫升  清理液（Reagent A），混勻細胞

7． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

8． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

9． 小心抽去上清液

10． 加入xx微升  裂解液（Reagent B），充分混勻

11． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

12． 強力渦旋震蕩15秒

13． 置于冰槽里孵育30分鐘

14． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

15． 小心移取500微升上清液到新的無菌的1.5毫升離心管

16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測定準備

1． 設(shè)置好冷光儀：溫度25℃，1秒延時（Delay），1秒整合（Integration）檢測。同時關(guān)上操作室的燈光

2． 測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  緩沖液（Reagent C）置入冰槽里融化，然后移出500微升到新的1.5毫升離心管，加入xx微升  反應(yīng)液（Reagent D），輕柔混勻后，置于冰槽里，標記為  反應(yīng)工作液，放在暗室冰槽里備用。然后進行下列操作。

三、 活性測定

1． 準備1個黑色96孔板 

2． 加入50微升待測樣品

3． 加入xx微升  反應(yīng)工作液

4． 室溫下（25℃）孵育1分鐘，避免光照

5． 即刻放進冷光儀檢測（1秒延時，1秒檢測）：獲得ATP相對發(fā)光單位（Relative Light Unit；RLU）

6． 室溫下（25℃）靜置10分鐘，避免光照

7． 即刻放進冷光儀檢測（1秒延時，1秒檢測）：獲得ADP背景相對發(fā)光單位（Relative Light Unit；RLU）

8． 加入xx微升  轉(zhuǎn)化液（Reagent E）

9． 室溫下（25℃）孵育1分鐘，避免光照

10． 即刻放進冷光儀檢測（1秒延時，1秒檢測）：獲得ADP相對發(fā)光單位（Relative Light Unit；RLU）

11． 計算樣品ADP/ATP比值

ADP/ATP比值=（ADP相對發(fā)光單位—ADP背景相對發(fā)光單位）÷ATP相對發(fā)光單位

12． 結(jié)果分析（參考）

注意事項

1． 本產(chǎn)品為50次操作

2． 所有操作均須無菌狀態(tài)下進行

3． 操作時，須戴手套

4． 建議每個樣品安排3個孔，即重復(fù)3次，計算時取其平均值

5．   反應(yīng)液（Reagent D）具有光高度敏感性，因此整個操作須避光進行，避免反復(fù)凍融

6． 由于ATP無處不在，且熱穩(wěn)定性。建議使用的槍頭、用具須嚴格無菌，避免重復(fù)使用；操作時避免污染試劑溶液，不得用手觸摸試劑容器的內(nèi)蓋

7． 如果用戶沒有冷光儀，可以使用閃爍探測器（scitillation counter 或β計數(shù)器）替代，但敏感性較低

8． 如果是注射式冷光儀，建議測試前后使用無離子水沖洗冷光儀注射（injector）管道

9． 本公司提供系列ATP檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感