細(xì)胞/組織線粒體內(nèi)鈣離子熒光染色試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

  細(xì)胞/組織線粒體內(nèi)鈣離子熒光染色試劑是一種旨在通過線粒體鈣離子特異性熒光探針Rhod-2-AM，進(jìn)入線粒體后，與鈣離子結(jié)合，其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光現(xiàn)象，來分析細(xì)胞/組織線粒體中總鈣離子的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種活體細(xì)胞或組織（動物、人體等）內(nèi)線粒體鈣離子的染色檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測敏感。

技術(shù)背景

鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì)，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細(xì)胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣，其構(gòu)成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進(jìn)一步分成具有活性的復(fù)合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運(yùn)輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。在細(xì)胞內(nèi)，鈣離子主要儲存在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器中。其中線粒體鈣離子在調(diào)節(jié)線粒體代謝、保持線粒體的ATP產(chǎn)量達(dá)到細(xì)胞需求，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境鈣離子平衡方面起著重要作用。Rhod-2-AM，羅丹明123（rhodamine 123）的衍生產(chǎn)物，進(jìn)入細(xì)胞受到酯酶解離，同時其正電荷特性，特異性地聚集在線粒體里，與鈣離子結(jié)合產(chǎn)生熒光，由此用于測定線粒體內(nèi)鈣離子水平。在熒光顯微鏡下，激發(fā)波長550nm，散發(fā)波長590nm，觀察紅色熒光現(xiàn)象。

產(chǎn)品內(nèi)容

  清理液（Reagent A）            毫升

  染色液（Reagent B）        微升

  介導(dǎo)液（Reagent C）            微升

產(chǎn)品說明書               1份

保存方式

保存  染色液（Reagent B）和  介導(dǎo)液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

細(xì)胞培養(yǎng)箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光染色觀察

實驗步驟

一、 測定準(zhǔn)備

1． 設(shè)定好（共聚焦）熒光顯微鏡（22℃）：激發(fā)波長550nm，散發(fā)波長590nm

2． 測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  染色液（Reagent B）室溫下融化，然后分別移出xx微升  介導(dǎo)液（Reagent C）和xx微升  染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，標(biāo)記為  染色工作液，并放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。 

二、（共聚焦）或熒光顯微鏡檢測

1）細(xì)胞樣品染色

1． 準(zhǔn)備1個待測的細(xì)胞爬片樣品

2． 小心加上xx微升  清理液（Reagent A），覆蓋樣品表面

3． 小心移去樣品上的  清理液（Reagent A）

4． 移取xx微升  清理液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管

5． 加入xx微升  染色工作液，混勻 

6． 小心加上上述  染色工作液到樣品上，覆蓋樣品表面

7． 室溫下（22℃），孵育30分鐘，避免光照

8． 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘，避免光照

9． 小心移去樣品上的  染色工作液

10． 小心加上xx微升新鮮的  清理液（Reagent A）

11． 小心移去  清理液（Reagent A）

12． 小心加上xx微升新鮮的  清理液（Reagent A）

13． 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘

14． 小心移去  清理液（Reagent A）

15． 蓋上蓋玻片

16． 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：激發(fā)波長550nm，散發(fā)波長590nm（線粒體鈣離子呈現(xiàn)紅色）

2）組織樣品染色

1． 取出待測的5至10微米厚的冰凍切片（注意：使用快速冷凍處理－snap frozen的冰凍切片，不宜使用包埋處理）

2． 小心加上xx微升  清理液（Reagent A），覆蓋切片樣品表面

3． 小心移去切片樣品上的  清理液（Reagent A）

4． 移取xx微升  清理液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管

5． 加入xx微升  染色工作液，混勻 

6． 小心加上上述  染色工作液到切片樣品上，覆蓋切片樣品表面

7． 室溫下孵育60分鐘，避免光照

8． 小心移去染色液

9． 小心移去  清理液（Reagent A）

10． 小心加上xx微升新鮮的  清理液（Reagent A）

11． 蓋上蓋玻片

12． 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：激發(fā)波長550nm，散發(fā)波長590nm（線粒體鈣離子呈現(xiàn)紅色）

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次操作

2． 操作時，須戴手套

3． 避免使用EDTA等處理樣品

4． 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光分析

5． 如果背景染色過高，可以調(diào)整  染色工作液使用劑量（1：100至1：1000容量比）

6． 本公司提供系列鈣生化檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感