MB10097.1 v.A

  通用型純化線粒體呼吸控制率（RCR）定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

  通用型純化線粒體呼吸控制率（RCR）定量檢測試劑是一種旨在通過極譜法檢測系統(tǒng)（polarographic system）測定新鮮活體線粒體在ADP存在（III態(tài)呼吸）與否（IV態(tài)呼吸）的情況下溶解氧（dissolved oxygen）的消耗差異，即呼吸控制率（RCR），以評價線粒體結(jié)構(gòu)和功能完整性以及氧化磷酸化效率的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。可以被用于線粒體生理功能和藥物作用機制等的研究。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

線粒體是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心。電子傳遞和ATP合成通過質(zhì)子梯度偶聯(lián)成一體。線粒體結(jié)構(gòu)完整，功能正常，底物充分，電子傳遞形成的質(zhì)子梯度不斷被消耗，電子得以順暢傳遞，氧氣快速消耗，其耗氧率大，為III態(tài)呼吸。ADP耗竭，質(zhì)子梯度不能消耗，阻礙電子傳遞，氧氣消耗減少，為IV態(tài)呼吸。 呼吸控制率（respiratory control ratio或respiratory control index；RCR），又稱呼吸調(diào)節(jié)比，是指III態(tài)（加入ADP）的呼吸速率與IV態(tài)（ADP耗竭）的呼吸速率之比。正常線粒體的RCR為3至10：RCR降低意味著線粒體ATP合成功能損傷，呼吸障礙；RCR增高意味著細胞活動旺盛，代謝加快。

產(chǎn)品內(nèi)容

  介質(zhì)液（Reagent A）            毫升

   IV態(tài)底物液（Reagent B）           微升

   III態(tài)底物液（Reagent C）           微升

產(chǎn)品說明書            1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

CLARK氧電極儀：用于測定溶解氧濃度

實驗步驟

實驗開始前，制備好新鮮的線粒體置于冰槽里備用；同時將－20℃冰箱里的試劑融化，并預熱氧電極儀到25℃。然后進行下列操作。

1． 加入xx毫升  介質(zhì)液（Reagent A）到反應玻璃槽

2． 使用微型磁力子攪拌，充分混勻

3． 密封反應槽

4． 開始記錄氧濃度：起始飽和氧濃度值為0.240微摩爾分子氧/毫升（25℃）

5． 持續(xù)記錄1分鐘后，注射加入20微升待測的線粒體（總量2毫克）（注意：氧濃度可能瞬時變化）

6． 持續(xù)記錄1分鐘后，注射加入xx微升   IV態(tài)底物液（Reagent B）――開始IV態(tài)呼吸（注意：參見注意事項9）

7． 持續(xù)記錄2分鐘：出現(xiàn)氧濃度緩慢下降

8． 繼續(xù)注射加入xx微升   III態(tài)底物液（Reagent C）（注意：氧濃度在10秒鐘內(nèi)開始下滑）――開始III態(tài)呼吸（注意：參見注意事項9）

9． 持續(xù)記錄直至出現(xiàn)線性下行斜線出現(xiàn)拐點

10． 分別測算III態(tài)呼吸速率和IV態(tài)呼吸速率：氧濃度降低值÷實際時間（分鐘）

11． 計算呼吸控制率：III態(tài)呼吸速率÷IV態(tài)呼吸速率

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次操作

2． 操作時，須戴手套

3． 確保反應玻璃槽潔凈，密閉，以免氧氣流入

4． 線粒體樣品須新鮮制備，建議不要凍存；制備的線粒體膜須完整，非常重要；建議使用  線粒體分離試劑盒－GMS10006.1

5． 注射加入反應槽時，避免氣泡和空氣注入

6． 避免乙醇污染；乙醇增加氧濃度；如果底物或抑制劑須使用乙醇溶解，則加注10微升

7． 保持反應槽溫度恒定，溫度降低，氧濃度升高

8． 反應液充分混勻，和環(huán)境氧保持平衡

9． 加注   IV態(tài)底物液（Reagent B）和   III態(tài)底物液（Reagent C）前，須充分凍融和混勻

10． 嚴格按照規(guī)定加注試劑，切莫增加加注試劑容量

11． 本公司提供系列線粒體檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感