線粒體是為細(xì)胞提供維持其在人體內(nèi)特定功能所需能量的重要結(jié)構(gòu)，它們作為通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的關(guān)鍵位點(diǎn)影響著能量代謝和穩(wěn)態(tài)，線粒體功能障礙對人類許多疾病都有著重大影響例如復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)疾病

作為動(dòng)態(tài)細(xì)胞器的線粒體會(huì)經(jīng)歷分裂和融合、在神經(jīng)元軸突內(nèi)運(yùn)動(dòng)和解體(線粒體自噬)的協(xié)調(diào)循環(huán)，這些動(dòng)態(tài)變化對于能量轉(zhuǎn)換和神經(jīng)元存活至關(guān)重要。因此，了解線粒體動(dòng)力學(xué)的變化非常有助于開發(fā)以線粒體為基礎(chǔ)的治療方案以治療復(fù)雜的病變?？焖賱?dòng)態(tài)活細(xì)胞成像與高內(nèi)涵篩選相結(jié)合，是實(shí)時(shí)大規(guī)模定量跟蹤這些變化的一種有效方案。本應(yīng)用展示了如何使用高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)Operetta@ CLS研究人類iPSC衍生神經(jīng)元的線粒體動(dòng)態(tài)變化。

一，細(xì)胞培養(yǎng)

對NeuroSight-S人hiPSC衍生神經(jīng)元進(jìn)行解凍、鋪板和培養(yǎng)。在包被好的PhenoPlate 384微孔板中每孔接種12000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)6天后神經(jīng)元細(xì)胞形成連續(xù)生長的軸突網(wǎng)絡(luò)。

二，化合物準(zhǔn)備與細(xì)胞染色

用培養(yǎng)基稀釋化合物（FCCP、Glutamate）并儲(chǔ)存在StorPlate 384 V-bottom微孔板中（每孔75µl）。細(xì)胞用10nM PhenoVue 551線粒體染色劑染色20分鐘，隨后在第一次圖像采集前用50µl維持培養(yǎng)基洗滌一次。

三，圖像采集設(shè)置

使用Operetta CLS進(jìn)行活細(xì)胞成像，共聚焦模式，40x水鏡，圖像輸出binning 3。這種拍攝組合使得PhenoVue 551通道能夠以低激發(fā)功率和短采集時(shí)間成像，這是確保線粒體在受到最小的光毒性/漂白作用下仍然有足夠強(qiáng)的信號和良好分辨率的最佳折衷方案。

熒光通道包括PhenoVue 551（PV）和Brightfield（BF），每個(gè)通道都可以單獨(dú)定義幀速以及時(shí)間點(diǎn)數(shù)量。PV通道以每秒2幀（fps）的速度（每孔）采集50個(gè)時(shí)間點(diǎn)的圖像。BF通道主要用于神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)識(shí)別參考，因此被設(shè)置為第二通道組，每孔僅采集一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的圖像。

四，化合物處理及成像

在細(xì)胞染色之后即對孔板進(jìn)行第一次成像以建立每孔的初始線粒體動(dòng)態(tài)狀態(tài)基線。然后細(xì)胞用20µM Glutamate、1µM FCCP、2.5µM FCCC或?qū)φ张囵B(yǎng)基進(jìn)行處理，隨后再對細(xì)胞進(jìn)行成像。

圖一. 線粒體動(dòng)態(tài)分?jǐn)?shù)檢測工作流程

五，圖像分析

使用Harmony®軟件分析時(shí)間序列圖像，以評估隨時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)線粒體分?jǐn)?shù)。為了準(zhǔn)確識(shí)別線粒體，第一步，用明場圖像識(shí)別神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)區(qū)域；第二步，在神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)區(qū)域中通過PhenoVue 551通道去除細(xì)胞體區(qū)域，并在剩下的區(qū)域中進(jìn)行線粒體分割。動(dòng)態(tài)線粒體分?jǐn)?shù)則定義為相鄰時(shí)間點(diǎn)線粒體面積（像素）的差值。最終輸出結(jié)果為每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)線粒體分?jǐn)?shù)與所有線粒體的面積比，這個(gè)比值代表了給定時(shí)間范圍內(nèi)的線粒體動(dòng)態(tài)（圖二）。數(shù)據(jù)結(jié)果表明在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中線粒體動(dòng)態(tài)分?jǐn)?shù)是穩(wěn)定的，證明了圖像采集條件的有效性。

圖二. 用于評估線粒體隨時(shí)間動(dòng)態(tài)的Harmony軟件中的圖像分析步驟

進(jìn)一步對加藥組進(jìn)行圖像分析，根據(jù)第一次基線測量建立的時(shí)間序列面積比平均值計(jì)算相對線粒體運(yùn)動(dòng)（圖三），數(shù)據(jù)結(jié)果表明在5至45分鐘的時(shí)間內(nèi)藥物作用對線粒體運(yùn)動(dòng)的影響都相當(dāng)穩(wěn)定，谷氨酸處理未顯示線粒體相對運(yùn)動(dòng)的顯著變化。而經(jīng)FCCP處理后線粒體的相對運(yùn)動(dòng)顯著下降。

圖三. 線粒體動(dòng)態(tài)計(jì)算結(jié)果

結(jié)論：

了解線粒體功能的病理變化對于開發(fā)基于線粒體的治療方案以治療復(fù)雜疾病（如癌癥、神經(jīng)疾病和代謝綜合征）至關(guān)重要。本應(yīng)用展示了如何使用Operetta CLS高內(nèi)涵活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)研究人iPSC衍生神經(jīng)元的線粒體動(dòng)力學(xué)。利用PhenoVue 551線粒體染色與低光毒性、高分辨率成像相結(jié)合，可以在不損害線粒體功能的情況下在長達(dá)1小時(shí)的時(shí)間內(nèi)檢測線粒體變化，建立高通量成像方法來分析神經(jīng)元中線粒體的動(dòng)力學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明活細(xì)胞成像與高通量篩選相結(jié)合是實(shí)時(shí)、大規(guī)模分析線粒體動(dòng)力學(xué)的一種有效方案。