退行性椎間盤疾?。―DD）是一種慢性脊柱疾病，其特征是椎間盤（IVD）結(jié)構(gòu)退變、蛋白水解活性增加、髓核（NP）細(xì)胞死亡和促炎細(xì)胞因子釋放。非生理性機(jī)械應(yīng)力（MS）被認(rèn)為是發(fā)生腰椎DDD的重要危險(xiǎn)因素。過度的MS會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解，從而導(dǎo)致IVD的顯著結(jié)構(gòu)變化。壞死性凋亡和細(xì)胞凋亡是與腰椎DDD有關(guān)的兩種主要程序性細(xì)胞死亡類型。盡管研究證據(jù)越來越多，但MS誘導(dǎo)的DDD的機(jī)制尚未wan全闡明。

MS誘導(dǎo)的線粒體活性氧（ROS）生成具有多種復(fù)雜機(jī)制，包括細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺ 超載和細(xì)胞骨架應(yīng)變。一些研究強(qiáng)調(diào)了線粒體ROS在NP細(xì)胞機(jī)械損傷中的重要性。過量的ROS生成通過對蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和細(xì)胞器造成損害來激活多種細(xì)胞凋亡途徑。近年來，越來越多的研究強(qiáng)調(diào)了線粒體ROS在NP細(xì)胞程序性死亡中的關(guān)鍵作用，為腰椎DDD的進(jìn)展提供了重要的新見解。

一些研究表明，高強(qiáng)度負(fù)荷是導(dǎo)致DDD的一個(gè)重要因素?；谶@一發(fā)現(xiàn)，中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院骨科、附屬第一醫(yī)院脊柱外科，深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科學(xué)科以及北京市創(chuàng)傷骨科研究所的一項(xiàng)聯(lián)合研究曾成功建立了椎間盤退變器官培養(yǎng)模型，目的是研究MS后程序性細(xì)胞死亡，ECM變性和線粒體ROS產(chǎn)生的發(fā)生。更重要的是，通過測量細(xì)胞反應(yīng)來評估MS、線粒體ROS、程序性細(xì)胞死亡和ECM變性的相關(guān)性，以幫助闡明DDD的分子病理生理學(xué)。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在 Oxidative Medicine and Cellular Longevity 期刊題為“Programmed NP Cell Death Induced by Mitochondrial ROS in a One-Strike Loading Disc Degeneration Organ Culture Model”。

首先，實(shí)驗(yàn)先檢測MS（40%應(yīng)變，1-7天）后不同時(shí)間點(diǎn)NP細(xì)胞中的ROS產(chǎn)生。數(shù)據(jù)顯示，MS顯著增加了ROS陽性細(xì)胞比例，并在前12小時(shí)內(nèi)保持在穩(wěn)定的高水平，之后，ROS陽性細(xì)胞的比例急劇下降，并在48小時(shí)達(dá)到低水平，而生理負(fù)荷培養(yǎng)組ROS陽性細(xì)胞比例保持穩(wěn)定。線粒體電子傳遞抑制劑魚藤酮顯著降低了MS后ROS陽性細(xì)胞的比例（~78%），線粒體ROS清除劑MitoQ也顯著降低了ROS陽性細(xì)胞的比例（~73%）。

然后，采用JC-1染色用于監(jiān)測MS后NP組織中的線粒體膜電位，觀察到MS組NP細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低，MitoQ預(yù)處理可部分減弱此效應(yīng)。這些結(jié)果表明，MS能夠直接誘導(dǎo)線粒體功能障礙。此外，計(jì)算GSSG/總谷胱甘肽比值以進(jìn)一步評估NP組織中的ROS水平，觀察到MS處理提高了GSSG/總谷胱甘肽比值，MitoQ預(yù)處理減弱了此效應(yīng)，而且MitoQ顯著抑制了MS引起的過氧化氫酶（CAT）的mRNA表達(dá)。這些結(jié)果表明，時(shí)間依賴性ROS積累主要來源于MS后的線粒體。

接下來，為了探索MS后NP細(xì)胞死亡機(jī)制，實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)了IVD，并隨后分析了不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力。MS在IVD中的應(yīng)用導(dǎo)致NP細(xì)胞活力的顯著時(shí)間依賴性降低（圖1 a、b），一小部分NP細(xì)胞在MS后立即死亡，超過70%的NP細(xì)胞死亡發(fā)生在MS后12至48小時(shí)內(nèi)。因此，MS后細(xì)胞死亡的程度和機(jī)制隨時(shí)間而變化。MS處理12小時(shí)后NP細(xì)胞活力的急劇下降表明，除了由MS直接引起的壞死外，程序性細(xì)胞死亡也被激活。因此，IVDs用Z-VAD-FMK、Nec-1或MitoQ預(yù)處理2小時(shí)，然后進(jìn)行MS，細(xì)胞活力分析表明，與MS組相比，抑制劑預(yù)處理顯著減輕了NP細(xì)胞的死亡（圖1 c）。

圖1    MS誘導(dǎo)的NP細(xì)胞死亡的時(shí)間過程。

進(jìn)一步地，實(shí)驗(yàn)研究了細(xì)胞凋亡指示基因（CASPASE3、BCL2和BAX）和壞死性凋亡指示基因（RIP1、RIP3和MLKL）的相對變化。MS后12小時(shí)，細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡基因的mRNA表達(dá)水平顯著升高，MitoQ預(yù)處理緩解了部分變化（CASPASE3、RIP1、RIP3和MLKL）。免疫熒光染色結(jié)果顯示，在MS后12小時(shí)，細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡（MLKL）基因水平顯著增加，MitoQ預(yù)處理顯著抑制程序性細(xì)胞死亡相關(guān)標(biāo)志物MLKL、CASPASE3和BAX的表達(dá)，提高BCL2的表達(dá)。此外，TUNEL染色表明MitoQ顯著逆轉(zhuǎn)了MS引起的NP細(xì)胞凋亡。

為了確定MS是否對NP細(xì)胞程序性死亡有長期影響，在7天持續(xù)的MS組中測量了細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡基因和蛋白質(zhì)的mRNA/蛋白質(zhì)水平。結(jié)果表明，這些標(biāo)志物的水平在7天MS組和7天CON組之間沒有顯著差異，凋亡水平同樣無顯著差異。

此外，還對NP組織進(jìn)行了代謝分析。與CON組（0.02-0.2?MPa；0.2?Hz；1 hour/day）相比，MS組在MS后12小時(shí)表現(xiàn)出上調(diào)的分解代謝基因（MMP1、MMP3和ADAMTS5）表達(dá)水平和下調(diào)的膠原II型α1（COL2A1）表達(dá)水平，MitoQ預(yù)處理可部分緩解MS誘導(dǎo)的代謝失調(diào)。為了進(jìn)一步研究代謝失調(diào)的程度，使用DMMB方法分析了累積糖胺多糖（GAG）釋放，MS在第7天顯著增加了累積GAG的釋放量，MitoQ 預(yù)處理部分防止了 GAG 的丟失。

zui后，觀察了IVDs的動(dòng)態(tài)壓縮剛度和形態(tài)。在MS后的第一天，CON、MS和MitoQ + MS組的動(dòng)態(tài)壓縮剛度變化沒有顯著差異（圖2 c）。與CON組相比，MS組IVDs在第7天表現(xiàn)出顯著較低的剛度，但這種差異被MitoQ減弱（圖2 d）。這些結(jié)果表明，MS部分通過線粒體ROS降低了IVD的硬度。然后，通過Safranin O/Fast Green和蘇木精染色評估IVDs的形態(tài)。MS應(yīng)用7天后，MS組的退行性變評分明顯高于CON組。此外，MS應(yīng)用后第4天和第7天之間的退化評分沒有顯著差異。在MitoQ預(yù)處理的IVDs中，退行性變評分顯著降低（圖2 e、f）。

圖2    線粒體ROS參與MS誘導(dǎo)的IVD動(dòng)態(tài)壓縮剛度降低和形態(tài)退行性改變。

總之，該研究的數(shù)據(jù)表明，在MS后的早期時(shí)間點(diǎn)，ROS誘導(dǎo)程序性NP細(xì)胞死亡和ECM降解，這些累積的ROS主要來自線粒體。這些發(fā)現(xiàn)表明，在MS后立即使用線粒體靶向的抗氧化劑可能是預(yù)防DDD發(fā)病或進(jìn)展的有希望的方法。研究結(jié)果也為DDD的病理機(jī)制提供了新的見解。

參考文獻(xiàn)：Li BL, Liu X, Gao M, Zhang F, Chen X, He Z, Wang J, Tian W, Chen D, Zhou Z, Liu S. Programmed NP Cell Death Induced by Mitochondrial ROS in a One-Strike Loading Disc Degeneration Organ Culture Model. Oxid Med Cell Longev. 2021 Aug 31;2021:5608133. doi: 10.1155/2021/5608133. PMID: 34512867; PMCID: PMC8426058.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34512867/

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