主要雜質(zhì)包括宿主細(xì)胞核酸、宿主細(xì)胞蛋白（包括令人生畏的染色質(zhì)形式）、衣殼聚集體、衣殼-DNA 復(fù)合物、以及具有不同核酸填充物不同組合的衣殼（從部分完整衣殼（partial capsid）裝載到包含進(jìn)宿主細(xì)胞 DNA ）。

如果說(shuō)空/實(shí)衣殼分離前的步驟（優(yōu)化宿主細(xì)胞中的AAV生產(chǎn)，裂解，色譜前步驟，如固相萃取 – 檢查Kryptonase，絮凝，酸化，疏水交換色譜，超濾/滲濾和AAV捕獲 - 如CIMmultus SO3陽(yáng)離子交換或親和層析）主要是針對(duì)宿主細(xì)胞DNA和不同形狀和形式的宿主蛋白，那么實(shí)衣殼分離就是接下來(lái)的第二個(gè)任務(wù)， 也就是拋光步驟。

需要補(bǔ)充的一點(diǎn)是，沒(méi)有適用于所有生產(chǎn)工藝的標(biāo)準(zhǔn)流程。不同的AAV血清型，宿主細(xì)胞的選擇，裂解方案以及下游的不同步驟會(huì)產(chǎn)生獨(dú)特的樣品，必須根據(jù)樣品定制實(shí)衣殼分離方案。

▼

色譜分離方法工具箱

為此，我們開(kāi)發(fā)了一個(gè)色譜分離方法工具箱，可用于尋求最佳純度和回收率。下面的研究結(jié)果是在分析型色譜柱（CIMac系列）上進(jìn)行的，其中注入了CEX-SO3純化的樣品。通過(guò)這些結(jié)果也可用于了解生產(chǎn)規(guī)模上使用 CIMmultus的情況（盡管考慮到分辨率略有下降 - 分析柱已根據(jù)分辨率進(jìn)行了優(yōu)化）。

CIMac™ AAV Empty/Full（等同：CIMmultus QA）是一種基于季胺（QA）的色譜柱（一種強(qiáng)陰離子交換柱），其中空衣殼和實(shí)衣殼的分離基于衣殼群體之間的電荷差異。AAV的洗脫是在堿性緩沖液中使用NaCl梯度實(shí)現(xiàn)的。

CIMac PrimaS™ Empty/Full（等同：CIMmultus PrimaS）采用離子交換-氫鍵多模式配基，可在pH梯度模式下分離空衣殼和實(shí)衣殼。這與季胺（QA）不同，QA中（假設(shè)所有其他條件保持不變）增加pH值會(huì)導(dǎo)致衣殼的強(qiáng)烈結(jié)合，這會(huì)導(dǎo)致洗脫時(shí)向更高電導(dǎo)率的轉(zhuǎn)變。在較高的pH值下上樣將增加分離效果。

CIMac™ PrimaT-Beta（等同：CIMmultus PrimaT）是一種用于空衣殼和實(shí)衣殼完全分離的多模式色譜柱，其功能等同于弱陰離子交換柱，此外該色譜柱還通過(guò)氫鍵和金屬離子與樣品相互作用。它可以使用MgCl₂和NaCl洗脫梯度的組合來(lái)分離空衣殼和實(shí)衣殼的不同亞群。

上面介紹的工作基于 Zvanut 等人的科學(xué)海報(bào)（2022），BIA Separations。

▼

方法

樣品是使用CEX - CIMmultusTM SO3部分純化的AAV2 / 8。PATfix系統(tǒng)（BIA Separations）用于色譜分離：

檢測(cè)器設(shè)置：

• 電導(dǎo)率和pH值

• 吸光度（260 nm，280 nm），50mm UV流通池

• 熒光（激發(fā)/發(fā)射：280/348 nm）

• 光散射（角度：90°）

使用的色譜柱：

CIMac™ AAV Empty/Full 0.1 mL 分析柱（1.3 μm 通道）;貨號(hào)：110.8503-1.3

CIMac PrimaS™ Empty/Full 0.1 mL 分析柱（2 μm 通道）;貨號(hào)：BIA-110.8504-2

CIMac™ PrimaT 0.1 mL Beta 分析柱（2 μm 通道）; 貨號(hào)：BETA 0009

流動(dòng)相和色譜方法

流速：1 mL/min

使用一系列結(jié)合和洗脫緩沖液（緩沖液A 30 CV、緩沖液B 30 CV、緩沖液A 30 CV）平衡色譜柱。進(jìn)樣后和梯度開(kāi)始之前，允許20 CV的結(jié)合緩沖液。

進(jìn)樣前先運(yùn)行3個(gè)用結(jié)合緩沖液代替的空白樣品。如果電導(dǎo)率和pH值尚未穩(wěn)定，可以運(yùn)行更多。

為了減少樣品殘留，注入在定量限度內(nèi)仍能產(chǎn)生結(jié)果的最小量（可能需要進(jìn)行測(cè)試）。

CIMac™ AAV Empty/Full

• 緩沖液A：20 mM BTP + 2 mM 氯化鎂 + 1 % 山梨糖醇 + 0.1 % poloxamer 188，pH 9.0

• 緩沖液B：20 mM BTP + 2 mM 氯化鎂 + 200 mM 氯化鈉 + 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer 188，pH 9.0

NaCl梯度：從100%緩沖液A到50%緩沖液B的5分鐘梯度。

CIMac PrimaS™ (AAV)

• 緩沖液A：10 mM BTP + 10 mM TRIS + 2 mM 氯化鎂 + 1 % 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer 188，pH 8.0

• 緩沖液B：10 mm BTP + 10 mM TRIS + 2 mM 氯化鎂 + 1 % 山梨糖醇 + 0.1 % poloxamer 188，pH 9.5*

*添加NaCl以實(shí)現(xiàn)緩沖液A和緩沖液B的相同電導(dǎo)率。

pH 梯度：從 100% 緩沖液 A 到 100% 緩沖液 B 的 2.5 分鐘梯度。

CIMac™ PrimaT-Beta

• 緩沖液A：25 mM HEPES、1% 蔗糖、0.1 % poloxamer， pH 7.0

• 緩沖液B：50 mM Tris、13.6 mM 硼 鹽、1 % 蔗糖、0.1 % poloxamer， pH 9.0

• 緩沖液C：50 mM Tris、9.6 mM 硼 鹽、50 mM 氯化鎂 2、1% 蔗糖、0.1 % poloxamer， pH 9.0

• 緩沖液D：50 mM Tris、12 mM 硼 鹽、2 M 氯化鈉、1% 蔗糖、0.1 % poloxamer， pH 9.0

梯度：從100%緩沖液B到100%緩沖液C的2.5分鐘梯度，然后從100%緩沖液B到100%緩沖液D的2.0分鐘梯度。

根據(jù)基于UV信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算分辨率：R = 2 t_F − t_E / w_F + w_E ，其中 t_F 和 t_E 是保留時(shí)間，w_F 和 w_E 是AAV實(shí)衣殼和空衣殼基線(xiàn)處的峰寬度。根據(jù)熒光計(jì)算空衣殼和實(shí)AAV衣殼的百分比（%E和%F）。將光散射添加到色譜圖中進(jìn)行比較。

結(jié)果和討論

比較所有三種色譜柱的結(jié)果，估算出的AAV空殼率和實(shí)殼率是近似的，即52%空殼率和48%實(shí)殼率。在這種情況下，使用熒光信號(hào)會(huì)產(chǎn)生比UV更接近實(shí)際狀態(tài)的結(jié)果。主要是因?yàn)榕c紫外線(xiàn)相比，熒光信號(hào)下AAV中的DNA裝載對(duì)讀數(shù)的影響較小，而核酸對(duì)紫外信號(hào)的吸收相當(dāng)顯著，因此會(huì)高估了實(shí)衣殼的比例。熒光信號(hào)可實(shí)現(xiàn)更微量級(jí)別的檢測(cè)和定量。

然而事情并不這么簡(jiǎn)單。色譜分離的不同目的意味著我們對(duì)色譜分離也有不同的要求。對(duì)于分析目的而言，良好的分辨率，但同樣重要的是測(cè)量?jī)煞N衣殼的色譜峰面積的難易程度。這里基于QA色譜柱的結(jié)果顯示，當(dāng)使用梯度方法時(shí)，很少能提供基線(xiàn)分離，但是空衣殼聚集在一個(gè)峰，實(shí)衣殼聚集到另一個(gè)峰，使得進(jìn)行面積測(cè)量相對(duì)容易。如果始終使用相同的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量（空衣殼峰在兩峰之間的最低點(diǎn)結(jié)束），則誤差是可重現(xiàn)的，因此可以保證可重現(xiàn)的并且可靠的分析。
 

 PrimaS色譜柱提供輪廓相似的色譜圖，其中兩個(gè)峰似乎相距更遠(yuǎn)（盡管稀釋倍數(shù)更高），但分辨率會(huì)降低。這確實(shí)意味著對(duì)于分析目的而言QA色譜柱可能更合適，但對(duì)于制備目的PrimaS更具有優(yōu)勢(shì)。補(bǔ)充一點(diǎn)，這些結(jié)論是基于已有案例，可能并非在所有情況下都是正確的——兩種色譜柱都可以用于分析和制備測(cè)試。

 另一方面，PrimaT色譜柱提供了非常不同的特異性，保證了空衣殼和實(shí)衣殼的不同亞群分離。根據(jù)已有的使用經(jīng)驗(yàn)，這可能是需要的或最好避免的。對(duì)于制備目的，需要收集和分析洗脫物質(zhì)的餾分，并考慮隨后應(yīng)如何富集這些餾分以獲得最佳純度。對(duì)于分析目的，PrimaT色譜柱確實(shí)可以讓我們更深入地了解空衣殼和實(shí)衣殼的組成，但在空殼和實(shí)殼被認(rèn)為是同質(zhì)的情況下，可能更難進(jìn)行一般性測(cè)量。我們預(yù)計(jì)未來(lái)將需要對(duì)亞種群結(jié)構(gòu)有更多的了解，因此PrimaT色譜柱提供了一個(gè)可以在此類(lèi)場(chǎng)景應(yīng)用的工具。PrimaT色譜柱也可以測(cè)試用于制備目的。

 一直以來(lái)，BIA Separations是質(zhì)粒DNA、AAV、mRNA高效率純化的。不僅提供整體柱及平臺(tái)方法，還提供定制的純化服務(wù)，以滿(mǎn)足質(zhì)粒DNA、AAV、mRNA規(guī)?；a(chǎn)的純化需求。