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通常會(huì)向超顯微術(shù)的學(xué)生介紹大家周知的“Peachey圖”。該圖顯示了切片厚度與它們?cè)诘恫壑衅r(shí)觀察到的干涉色之間的關(guān)系，并被超微切片機(jī)的漫射白光照亮（Peachey，1958)。自從他的第一篇文章以來，早期的超微計(jì)制造商之一lvan Sorvall,lnc.制作了干涉色與切片厚度的圖表，該圖表被其他商業(yè)公司復(fù)制，并在電子微鏡實(shí)驗(yàn)室中變得非常普遍。然而，這張圖表是藝術(shù)家對(duì)Peachey的原始數(shù)據(jù)的再現(xiàn)，并沒有準(zhǔn)確地描繪出現(xiàn)代超微光度計(jì)改進(jìn)的照明和設(shè)計(jì)所看到的顏色。因此，RMC Boeckeler進(jìn)行了一項(xiàng)簡(jiǎn)單的研究，以顯示干涉色，觀察并拍攝了嵌入常用環(huán)氧樹脂中的典型生物標(biāo)本。
使用儀器
本研究使用了The RMC Boeckeler PowerTome。它配備了一個(gè)機(jī)械推進(jìn)系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有一個(gè)高重復(fù)性切割臂推進(jìn)的精密數(shù)字線性標(biāo)尺。這款先進(jìn)的超高倍顯微鏡還配有觸摸屏電腦和帶高清攝像頭的三目立體顯微鏡，用于拍攝切片時(shí)的圖片和視頻。該成像系統(tǒng)還有一個(gè)測(cè)量工具，可用于測(cè)量切片尺寸和面積，以便與樣品塊表面的尺寸和面積進(jìn)行比較，從而估算切片壓縮量。
本研究使用了The RMC Boeckeler PowerTome。它配備了一個(gè)機(jī)械推進(jìn)系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有一個(gè)高重復(fù)性切割臂推進(jìn)的精密數(shù)字線性標(biāo)尺。這款先進(jìn)的超高倍顯微鏡還配有觸摸屏電腦和帶高清攝像頭的三目立體顯微鏡，用于拍攝切片時(shí)的圖片和視頻。該成像系統(tǒng)還有一個(gè)測(cè)量工具，可用于測(cè)量切片尺寸和面積，以便與樣品塊表面的尺寸和面積進(jìn)行比較，從而估算切片壓縮量。
程序
將小鼠脾臟固定在4%甲醛和1%戊二醛中，并后包埋在來自電子顯微鏡科學(xué)公司（EMS，哈特菲爾德，賓夕法尼亞州，美國）的Embed 812樹脂中。這是一種常用的EPON812替代樹脂，是許多實(shí)驗(yàn)室中用于生物標(biāo)本的環(huán)氧樹脂混合物的代表。按照制造商的說明，使用硬混合物。使用生產(chǎn)PT PCZ超薄切片機(jī)進(jìn)行切片。使用Mitutoyo千分尺（型號(hào)#ID-C112E)，通過獨(dú)立的方法驗(yàn)證切割臂的機(jī)械前進(jìn)，該測(cè)微計(jì)（千分尺）可以讀取1um增量的線性距離。使用儀器控制器使切片臂前進(jìn)10 um,并將這些距離與Mitutoyo千分尺在切割臂整個(gè)200um前進(jìn)范圍內(nèi)的讀數(shù)進(jìn)行比較。這兩個(gè)讀數(shù)在1%的誤差范圍以內(nèi)。切割臂的機(jī)械推進(jìn)是通過步進(jìn)電機(jī)和數(shù)字線性推（前）進(jìn)系統(tǒng)的反饋控制來實(shí)現(xiàn)的，因此，超薄切片的較小推進(jìn)預(yù)計(jì)也同樣準(zhǔn)確。例如，100納米步進(jìn)多個(gè)累加增量導(dǎo)致在Mitutoyo千分計(jì)上的讀數(shù)與1微米和10微米的較大進(jìn)階相同。
在30nm至400nm范圍內(nèi)切割切片，并在切片時(shí)和在CHCI3蒸汽”拉伸”（減壓）后拍照。設(shè)置相機(jī)的增益和曝光設(shè)置，使得生成的圖像與通過立體顯微鏡直接觀察到的顏色和亮度緊密匹配。使用圖像處理軟件lmageJ（NIH，USA)排列切片圖像，以產(chǎn)生圖2。
結(jié)果
RMC Boeckeler PowerTome PCZ穩(wěn)定而精確的先進(jìn)系統(tǒng)是切片典型環(huán)氧樹脂包埋標(biāo)本以記錄切片干涉色的*佳選擇。厚度在70納米和100納米之間的切片的金色的細(xì)微變化很容易區(qū)分。在170納米附近可以看到明亮的藍(lán)色，比Peachey最初在舊儀器上報(bào)告的190納米到240納米要薄得多。
圖2顯示了CHCla”拉伸“的切片截面，這是許多實(shí)驗(yàn)室的準(zhǔn)技術(shù)。其他人經(jīng)常使用一種裝置，使加熱的絲經(jīng)過該部分，以獲得該部分的類似減壓。切片的解壓縮有利于改善切片在透射電子顯微鏡（TEM）的光束內(nèi)拉伸和移動(dòng)的效果。我們發(fā)現(xiàn)，與樣品塊面相比，截面長(zhǎng)度壓縮了大約10%。在CHClg拉伸后，壓縮減少到約8%。因此，這些部分的實(shí)際厚度可以等效地減小。圖2是由一臺(tái)儀器制作的實(shí)際切片構(gòu)建而成，該儀器被證實(shí)是精確的，為超微切片師提供了更精確和更新的參考，因此比以前由藝術(shù)家制作和商業(yè)發(fā)行的圖表更有用。此圖表還涵蓋了更大的厚度范圍，展示了一些干涉色如何隨著切片厚度的增加而重復(fù)出現(xiàn)。
參考Peachey,L.D.(1958)J.Biophys。生物化學(xué)Cytol.4,233.
Sjo strand,F.S.(1967)細(xì)胞和組織的電子顯微鏡 Electron Microscopy of Cells andTissues281-287。
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