當(dāng)前生物醫(yī)藥行業(yè)面臨著藥物靶點同質(zhì)化嚴(yán)重的問題，確認(rèn)疾病的作用機制并尋找全新的、有效的、安全的藥物靶點將成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和創(chuàng)新藥物開發(fā)的有效措施，基于高通量全基因組CRISPR篩選可以為此提供很好的幫助。

CRISPR / Cas9已成為一種流行的基因編輯工具，因為它易于使用，并且與其他基因調(diào)節(jié)工具（例如siRNA技術(shù)）相比，脫靶效應(yīng)更少。CRISPR/Cas9敲除篩選文庫的形式主要有混合文庫和陣列文庫，已被廣泛用于靶點識別和機制分析。雖然混合文庫的 CRISPR/Cas9 篩選通常更便宜且耗時更少，但陣列式 CRISPR/Cas9 篩選在終點功能分析中提供了更多的技術(shù)靈活性。此外，與混合文庫的 CRISPR 方法相比，陣列式 CRISPR/Cas9 篩選的基因型-表型相關(guān)性通常更加直接。

全基因組 CRISPR 篩選以識別人肝星狀細(xì)胞中TGF-β 誘導(dǎo)的肝纖維化的驅(qū)動因素

題目

Genome-wide CRISPR Screening to Identify Drivers of TGF-β-Induced Liver Fibrosis in Human Hepatic Stellate Cells

日期

2022-03-11

期刊

ACS Chem Biol

2022年3月11日,Takeda公司的開發(fā)團(tuán)隊在ACS Chem Biol上發(fā)表題為Genome-wide CRISPR Screening to Identify Drivers of TGF-β-Induced Liver Fibrosis in Human Hepatic Stellate Cells 的文章，為了進(jìn)一步了解肝纖維化的驅(qū)動機制，作者開發(fā)了一個高通量全基因組CRISPR/Cas9篩選平臺來鑒定肝星狀細(xì)胞(HSC)來源的TGF-β誘導(dǎo)的肝纖維化。該研究描述的功能基因組學(xué)表型篩選平臺揭示了TGF-β誘導(dǎo)的肝纖維化的新生物學(xué)機制和肝纖維化的潛在藥物靶點。

作者使用ACTA2蛋白表達(dá)作為HSC激活的水平，首先確認(rèn)了HSC對TGF-β的反應(yīng)，并確認(rèn)了進(jìn)行CRISPR/Cas9的最佳轉(zhuǎn)染條件，包括電脈沖參數(shù)，crRNA及tracrRNA濃度，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù)，鋪板密度等。

隨后按照以下工作流程使用陣列式全基因組CRISPR/Cas9進(jìn)行高通量篩選敲除潛在靶基因，通過計算ACTA2表達(dá)的抑制百分比及細(xì)胞活率，最終從19,027個基因中篩選出了52個基因，其中部分基因為已經(jīng)被預(yù)測可以通過傳統(tǒng)的小分子和抗體藥物來調(diào)節(jié)干預(yù)。

為了確認(rèn)這些基因在改善HSC纖維化方面的作用，作者在HSC中單獨敲除了這些基因，并評估這些基因的缺失對TGF-β誘導(dǎo)的14種生物標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄譜的影響。

同時，構(gòu)建器官型肝模型進(jìn)行共培養(yǎng)，評估纖維化模型中上述基因的表達(dá)水平。與GEO profiles數(shù)據(jù)庫中發(fā)布的公開可用的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析。結(jié)果進(jìn)一步支持了作者篩選的基因在肝纖維化發(fā)病過程中對HSC的潛在調(diào)控作用。

在對生物標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄譜影響的實驗中，作者發(fā)現(xiàn)PSMC2的缺失可以抑制多個標(biāo)志物，并進(jìn)一步確認(rèn)小分子抑制蛋白酶體活性可以解決TGF-β誘導(dǎo)的HSC活化。

隨后，作者評估了小鼠肝纖維化bacTRAP試驗中候選基因的表達(dá)水平，確認(rèn)了這些候選基因在HSC中特異性富集。

作者還在UK Biobank上進(jìn)行了MAGMA分析，確認(rèn)部分基因的遺傳變異可能會影響NASH和肝纖維化的生物標(biāo)志物。

最后作者總結(jié)了這些研究的結(jié)果并對每個靶基因進(jìn)行了評分。更高的分?jǐn)?shù)表明該基因可能是肝纖維化的潛在靶標(biāo)。

總之，作者通過構(gòu)建肝纖維化的生理模型，通過高通量全基因組CRISPR/Cas9篩選平臺從19,027個基因中篩選出52個潛在基因可能在激活的HSC誘導(dǎo)的肝纖維化中起作用，通過一系列的驗證及對比并為10個基因進(jìn)行評分，這些基因?qū)殚_發(fā)下一代肝纖維化療法提供了進(jìn)一步可能。

當(dāng)前生物醫(yī)藥行業(yè)面臨著藥物靶點同質(zhì)化嚴(yán)重的問題，確認(rèn)疾病的作用機制并尋找全新的、有效的、安全的藥物靶點將成為創(chuàng)新藥物開發(fā)的有效措施，基于高通量全基因組CRISPR篩選可以為此提供很好的幫助。本研究中使用了Lonza的384-well高通量Nucleofector做為遞送CRISPR/Cas9的工具，在短時間內(nèi)完成全基因組CRISPR/Cas9篩選。

在近幾年的科學(xué)研究中，我們也看到了384-well Nucleofector可以很好的幫助客戶完成高通量CRISPR/Cas9篩選，siRNA篩選以及細(xì)菌的CRISPR-Prime編輯的工作中[1-6]。更多疾病機理研究和藥物開發(fā)應(yīng)用案例，可參考文章

基于成熟的 NucleofectorTM 技術(shù)

快速 —— 1分鐘內(nèi)處理一個384孔板

易于使用 —— 使用現(xiàn)有的96 孔 Shuttle 方案

材料消耗與高性能結(jié)合 —— 轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)可低至2×104

自動化兼容 —— 專為集成到液體處理平臺而設(shè)計

基于20年在外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法的開發(fā)經(jīng)驗，及大量的客戶反饋，Lonza開發(fā)出的4D-NucleofectorTM靈活性和可靠性滿足客戶的需求。除384-well Nucleofector外，Lonza還可以提供不同維度的轉(zhuǎn)染模塊來應(yīng)對不同的場景需求。