冬的精靈跖起腳尖，掠過樹頂，染紅幾片葉子，然后又乘著一簇飛掠過山谷離開。初冬的愁，結(jié)在了愈來愈孤立的寒枝上，化作片片飄零的紅葉，融在了冬蟲漸唱漸衰的悲鳴中。

通蔚給您講解細胞培養(yǎng)三大步驟：

一、復(fù)蘇

細胞復(fù)蘇的原則： 快速融化

必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結(jié)晶，對細胞造成損害。

實驗前準(zhǔn)備

將水浴鍋提前預(yù)熱至37℃。

細胞實驗室進行常規(guī)消毒，用75％酒精擦拭紫外線照射40min的超凈工作臺臺面，保證無菌。

在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等即將使用的耗材及試劑。

取出凍存管

根據(jù)細胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細胞的對應(yīng)編號。

從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。

迅速解凍

迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。

約1-2min后凍存管內(nèi)液體wan全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。

二、傳代

1.傳代密度過高

一旦細胞養(yǎng)太久至融合度過高（>90%）才傳代，容易使細胞產(chǎn)生老化現(xiàn)象，甚至是堆疊，再消化細胞時不易吹打成單顆細胞，即便再重新鋪盤傳代，細胞也無法回到原本的特性了。（如：單層細胞，沒長滿就發(fā)生堆疊現(xiàn)象）。

解決方案

盡量避免融合度過高，鏡下觀察融合度約達到80%即可傳代分盤。

細胞融合度：在細胞培養(yǎng)中指的是細胞在培養(yǎng)表面（培養(yǎng)皿/瓶）所占的比例。

2.傳代密度過低

哺乳動物貼壁培養(yǎng)細胞，若細胞培養(yǎng)到 80-90%密度需要開始傳代，在傳代接種細胞密度過低，細胞間距離太遠，就無法在細胞間產(chǎn)生黏附及通信作用，幫助信號傳導(dǎo)并活化細胞；總體細胞量不足，分泌的生長因子濃度會不足以產(chǎn)生利于生長的微環(huán)境，以上皆會造成增殖速度遲緩或細胞死亡。

解決方案

細胞傳代時，要進行準(zhǔn)確的細胞計數(shù)，確保鋪盤的密度。

三、凍 存

細胞凍存的基本原理： 慢凍

手動降溫：將細胞依序放在4℃（30分鐘）、-20℃（1小時）、-80℃（過夜）后移至液氮中保存。

程序降溫盒：是一般最guang泛使用的降溫法，為一種特制冷凍容器（填充異丙醇或依靠特制金屬導(dǎo)熱），使細胞以每分鐘約-1℃的速度降至-80℃（過夜），然后移至液氮中保存。