背景介紹：

羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）是蛋白質和多肽前體的重要組成部分，是一種游離氨基酸，在體內沒有代謝途徑，主要以原型經尿排出，其生理功能與賴氨酸類似，都是構成氨基酸的一種重要成分。羥脯氨酸在體內具有多種生物學功能，與體內許多重要的生理活動和病理變化密切相關，在哺乳動物中，它僅存在于膠原蛋白和彈性蛋白中，但在植物中，許多蛋白質都含有羥脯氨酸。人體中含有大量羥脯氨酸，它既是合成蛋白質的原料，又是合成抗體和細胞因子等物質的前體，多種疾病如腫瘤、炎癥等都會影響膠原蛋白更新，并可能導致血清或尿液羥脯氨酸升高。

羥脯氨酸檢測在肺纖維化中的應用：

各項研究指示，膠原蛋白的過度沉積是纖維化疾病的主要特征，而羥脯氨酸（HYP）作為膠原蛋白所有的一種氨基酸，其含量約占膠原蛋白總氨基酸的13%，因此，采用比色法、 HPLC等生化方法測定組織中羥脯氨酸的總含量逐漸成為纖維化嚴重程度評價常用的方法學，在2017年該方法學更是被美國胸科協(xié)會指南確立為肺纖維化臨床前評價的“金標準”。

2023年3月，中國科學技術大學基礎醫(yī)學院陳永艷副教授團隊在Immunity & Ageing期刊上發(fā)表了題為“UGRP1-modulated MARCO+ alveolar macrophages contribute to age-related lung fbrosis”的研究論文。本研究主要探討了老化的肺部容易受到慢性肺部疾病的影響，發(fā)現(xiàn)老化的呼吸道上皮細胞顯著上調子宮球蛋白相關蛋白1（UGRP1）的表達，從而導致衰老肺中CCL6水平升高，而肺泡巨噬細胞（AM）隨著衰老而發(fā)生本質變化，表現(xiàn)出細胞數(shù)量減少和基因表達改變；UGRP1和MARCO+AM的上調參與了肺纖維化的進展。因此UGRP1以CCL6依賴的方式調制與年齡相關的肺纖維化的MARCO⁺AM，是為老齡化人群建立最佳靶向的關鍵。

圖 運用羥脯氨酸含量檢測試劑盒abs580066對肺組織進行檢測

羥脯氨酸含量檢測試劑盒：

另需自備的材料：酶標儀（可讀取560nm處的吸光度）、蒸餾水、移液器與槍頭、研缽、離心機、高壓滅菌器、6mol/L HCl、10mol/L NaOH、酒精等。

操作步驟（以組織樣本為例）：

1、樣本處理：稱取1g組織于玻璃管中，加入1mL 6mol/L HCl，放入110℃烘箱中6~12h，離心機16000g 25℃離心20min，取上清液至新離心管中 ，然后加10mol/L NaOH調節(jié)pH至7.0。

2、試劑準備：

1）Substrate：加入8mL Substrate Diluent溶解。（現(xiàn)配現(xiàn)用）
2）Dye Reagent：加入4mL Dye Reagent Diluent溶解。（現(xiàn)配現(xiàn)用）
3）標準品：加入1mL蒸餾水溶解Standard得到Standard①；從Standard①取10μL加入990μL蒸餾水中得到Standard②；取200μL Standard②加入800μL蒸餾水中，制備得到濃度為200μmol/L的Standard。

標準品二倍連續(xù)稀釋示例

3、上樣：
1）分別將40uL不同濃度的標準品、樣品加入相應孔中，另設置空白孔加入40uL蒸餾水；
2）每孔分別加入80uL Substrate，混合均勻，室溫孵育20min；
3）每孔分別加入40uL Stop Solution，混合均勻，室溫孵育10min；
4）每孔分別加入40uL Dye Reagent，混合均勻，放入65℃烘箱中反應20min，冷卻至室溫。

4、檢測與計算：使用酶標儀測量560nm處的吸光度，擬合標準曲線并計算樣本濃度

注意事項：

1）對于未知的樣品，建議多做幾個稀釋梯度進行預實驗，確保讀數(shù)在標準曲線范圍內；
2）試劑盒中的試劑需要現(xiàn)配現(xiàn)用，配好的溶液無法儲存，可能影響顯色讀數(shù)進而影響檢測；如果樣本需要分批檢測，建議分批收樣儲存，待樣本收齊后統(tǒng)一檢測；
3）每次實驗必須重新檢測并繪制標準曲線。

Absin生化檢測試劑盒——氨基酸代謝系列：

Chen Y, Hao X, Li M, Tian Z, Cheng M. UGRP1-modulated MARCO+ alveolar macrophages contribute to age-related lung fibrosis. Immun Ageing. 2023 Mar 18;20(1):14. doi: 10.1186/s12979-023-00338-8. PMID: 36934284; PMCID: PMC10024420.

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