為更好滿足AAV病毒純化過程中高鹽環(huán)境對全能核酸酶的活性要求， 逐典生物自主開發(fā)出耐高鹽版本全能核酸酶，在高鹽條件下，仍具有高酶活，是AAV病毒生產(chǎn)及其它生物工藝流程中去除核酸污染的理想選擇。

基因治療是一種利用基因治療載體將外源的治療性基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞，通過外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，改變細(xì)胞原有基因表達以治療疾病的方法。腺相關(guān)病毒（AAV）載體具有不整合宿主基因組、靶向組織特異性等核心優(yōu)勢成為最成功的基因治療遞送載體之一。隨著AAV基因治療的研究從實驗室開發(fā)轉(zhuǎn)向臨床規(guī)?；a(chǎn)，AAV病毒載體的上游生產(chǎn)和下游純化過程仍然面臨重要挑戰(zhàn)。

AAV gene transfer therapy mechanism of action. Mol Ther Methods Clin Dev. 2022;25:74-83.

一，AAV病毒的工業(yè)生產(chǎn)

AAV病毒載體的生產(chǎn)流程跟抗體、疫苗類藥物的生產(chǎn)類似，主要包含上游培養(yǎng)、下游純化以及制劑部分。其中，病毒生產(chǎn)流程的后半部分需要從工藝和產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)中純化病毒顆粒，這些下游處理步驟可能占病毒生產(chǎn)總成本的很大一部分，因此高效地產(chǎn)生高純度病毒非常重要。一般下游操作主要包括：(1)用去污劑、機械作用、高滲或凍融操作裂解細(xì)胞釋放病毒；(2)核酸去除，裂解物經(jīng)全能核酸酶消化以減少核酸污染物；(3)在色譜純化前通過離心或微濾去除細(xì)胞碎片和碎片；(4)親和層析，去除宿主細(xì)胞蛋白(HCPs)和任何血清蛋白雜質(zhì)；(5)用氯化銫梯度超離心法從空殼病毒、非感染性病毒中分離包含全基因的完整病毒顆粒。

Timeline for GMP manufacture of AAVs – Example

二，常規(guī)全能核酸酶在AAV生產(chǎn)中的作用和限制

根據(jù)WHO和各國藥物注冊監(jiān)管機構(gòu)要求，生物制劑中殘留的宿主DNA的劑量不得超過100 pg/劑量，部分特殊情況下不得高于10 ng/劑量，基于此，常使用全能核酸酶應(yīng)用于生產(chǎn)工藝流程中來去除核酸污染。在AAV病毒生產(chǎn)中，經(jīng)宿主細(xì)胞大量擴增，在細(xì)胞裂解后，往往需要加入全能核酸酶來去除核酸污染，同時可以降低粘樣品稠度，便于后續(xù)上柱純化。值得注意的是，在AAV病毒純化過程中，為提高病毒收率，常使用含有較高鹽濃度的buffer（400-500mM），而常規(guī)版本全能核酸酶的酶活會隨著鹽濃度升高而急劇下降，實際使用中，常需要通過增加酶的用量或延長孵育時間來提高純化效果，但這無疑增加了AAV純化成本和工藝復(fù)雜度。

宿主核酸與AAV病毒纏繞在一起，影響核酸酶的酶切效果

實際上，鹽是各種純化方案的重要組成部分，鹽濃度的提高可有效地減少AAV病毒顆粒的聚集，提高AAV病毒顆粒產(chǎn)率。

三，逐典耐高鹽核酸酶應(yīng)用案例：

四，逐典耐高鹽全能核酸酶優(yōu)勢

1.更高鹽耐受度

當(dāng)鹽離子濃度在600~700mM時，初代全能核酸酶幾近失活，而SAN仍能保持較高活性。

圖1.不同鹽濃度下耐高鹽全能核酸酶(SAN)與初代全能核酸酶活性對比

2.高效核酸降解力

同對照組相比，添加SAN后能夠有效去除核酸殘留。

圖2 加入SAN 前后的消化效果圖