泛素為含76個(gè)氨基酸組成的高度保守的小分子蛋白質(zhì)、大小約為8.6 kDa，在蛋白質(zhì)降解和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要作用。泛素具有7個(gè)賴氨酸殘基(K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63)和一個(gè)甲硫氨酸殘基(M1)，泛素之間主要通過賴氨酸殘基和甲硫氨酸殘基進(jìn)行各種連接，由此產(chǎn)生的泛素鏈產(chǎn)生一定的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),可通過對(duì)蛋白底物進(jìn)行修飾并決定底物的功能。泛素可以通過其C-末端與靶蛋白上的賴氨酸殘基的胺基團(tuán)結(jié)合。這種結(jié)合被稱為單一泛素化。額外的泛素基團(tuán)可以通過泛素中的七個(gè)賴氨酸殘基之一與初始泛素結(jié)合。這些泛素鏈的形成被稱為多泛素化。其中最為研究的多泛素化形式是通過泛素的第48位賴氨酸（K48鏈）形成鏈。單一泛素化已被證明可以改變靶蛋白的定位、活性和/或功能。多泛素化常見的后果是通過蛋白酶體介導(dǎo)的靶蛋白降解。

將泛素連接到靶蛋白需要三種不同連接酶的協(xié)同作用，即E1（泛素活化酶）、E2（泛素結(jié)合酶）和E3（泛素連接酶），從而在泛素的C-末端和靶蛋白上的賴氨酸殘基的ε-氨基團(tuán)之間形成異肽鍵。泛素E3連接酶充當(dāng)骨架蛋白，為泛素結(jié)合酶（E2）和目標(biāo)底物提供?？课稽c(diǎn)。通常，E3連接酶介導(dǎo)將泛素從E2硫酯中間體轉(zhuǎn)移至底物蛋白的酰胺連接（Hershko and Ciechanover, 1998）。除了對(duì)底物的泛素化，E3連接酶還可以對(duì)自身進(jìn)行“自我泛素化”。  

LifeSensors的PROTAC體外泛素化檢測(cè)試劑盒旨在通過監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)固有的泛素化能力，可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)PROTAC的效率。  

艾美捷PROTAC體外泛素化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)原理：

使用預(yù)涂有專有的TUBE試劑（檢測(cè)板）的微孔板條，用于捕獲PROTAC依賴反應(yīng)中形成的多泛素鏈。在檢測(cè)過程中，首先將PROTAC加入到檢測(cè)板中，然后加入E3連接酶和待檢測(cè)的目標(biāo)蛋白，以形成三元復(fù)合物。接下來，將含有野生型泛素和ATP的E1-E2酶混合物加入到孔中，以啟動(dòng)PROTAC介導(dǎo)的泛素化反應(yīng)。在反應(yīng)過程中，E1-E2-E3機(jī)制生成的多泛素鏈被識(shí)別并捕獲在孔中。在反應(yīng)和隨后的洗滌步驟后，將分離的多泛素化產(chǎn)物與目標(biāo)蛋白的抗體（不包含在內(nèi)）和與-HRP偶聯(lián)的二抗（包含在內(nèi)）一起孵育，以便通過化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。因此，在這種“三明治”ELISA樣的檢測(cè)方法中，捕獲的多泛素化產(chǎn)物產(chǎn)生的信號(hào)是PROTAC活性的定量指標(biāo)。

PROTAC體外泛素化檢測(cè)試劑盒組分：

注意：將所有材料儲(chǔ)存于-80?C，避免多次凍融循環(huán)。所有組分至少穩(wěn)定保存2個(gè)月。

1：體外泛素化檢測(cè)板：注意不要將檢測(cè)板迅速解凍至室溫。建議最初將檢測(cè)板放置在4°C下30分鐘，然后再轉(zhuǎn)移到室溫下。

2：10倍檢測(cè)緩沖液：規(guī)格：1.2 mL，注意：在1倍檢測(cè)緩沖液中新鮮添加β-巰基乙醇，最終濃度為1mM。

3：E3混合液（2倍濃度）：規(guī)格：1 x 250 ul（20倍濃度），注意：將選擇的目標(biāo)蛋白以40-80 nM的濃度加入提供的E3混合液中，以促進(jìn)PROTAC和E3連接酶的三元復(fù)合物形成。

4：E1-E2-泛素混合液（2倍濃度）：規(guī)格：1 x 250 ul（20倍濃度）

5：二抗（抗小鼠或抗兔HRP偶聯(lián)）：規(guī)格：60uL（100倍濃度）

6：檢測(cè)試劑1和2：規(guī)格：1 mL的檢測(cè)試劑1和1 mL的檢測(cè)試劑2

7：阻斷濃縮液（5倍濃度）：規(guī)格：5 mL

8：陽(yáng)性對(duì)照試劑

DMSO中的PROTAC（50倍濃度）：10 uL（MZP54，dBET6，A1874）

目標(biāo)蛋白陽(yáng)性對(duì)照BRD3（20倍濃度）：20 uL

抗-BRD3抗體（100倍濃度）：5 uL

抗小鼠HRP偶聯(lián)物（100倍濃度）：5 uL   

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