細(xì)胞檸檬酸合成酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

細(xì)胞檸檬酸合成酶活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過檸檬酸合成酶反應(yīng)系統(tǒng)中釋放出巰基輔酶A，使用Ellman試劑后，產(chǎn)生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物吸光峰值的變化，即采用比色法來測(cè)定細(xì)胞裂解樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解懸液樣品（動(dòng)物、人體等）檸檬酸合成酶的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

檸檬酸合成酶（citrate synthase；E.C. 2.3.3.1），又稱為檸檬酸生成酶（citrogenase），存在于所有生命體中，主要位于真核細(xì)胞線粒體內(nèi)基質(zhì)膜中，作為線粒體的定量標(biāo)記之一。檸檬酸合成酶是三羧酸循環(huán)（Tri Carboxylic Acid cycle；TCA cycle）或檸檬酸循環(huán)（citric acid cycle）或克雷伯循環(huán)（Krebs Cycle）的第一步，其催化來自于乙酰輔酶A（acetyl CoA）的二碳乙酸與四碳草酰乙酸（oxaloacetate）分子的縮合（condensation）反應(yīng)，生成六碳檸檬酸，釋放出能量供細(xì)胞使用。檸檬酸合成酶為同源二聚體， 共有437氨基酸。每個(gè)亞體含有20個(gè)α螺旋體（α－helices）。基于草酰乙酸結(jié)合檸檬酸合成酶后，酶的構(gòu)象發(fā)生改變，產(chǎn)生與乙酰輔酶A結(jié)合的機(jī)會(huì)，同時(shí)硫酯（thioester）水解，并釋放出巰基輔酶A（CoA－SH），與Ellman試劑5，5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5，5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過其吸收峰值的變化（412nm波長(zhǎng)），來定量分析檸檬酸合成酶的活性。檸檬酸合成酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）        毫升

裂解液（Reagent B）        毫升

緩沖液（Reagent C）        毫升

反應(yīng)液（Reagent D）        毫升

底物液（Reagent E）             毫升

陰性液（Reagent F）          毫升

產(chǎn)品說明書              1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于脫離細(xì)胞

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

比色皿或酶標(biāo)板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）

7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)412nm，間隔5分鐘，讀數(shù)3次（共15分鐘），并置零

2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照

三、 背景對(duì)照測(cè)定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入xx微升陰性液（Reagent F）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

四、 樣品測(cè)定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入50微升待測(cè)樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

9． （選擇步驟）重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至10，測(cè)讀新的樣品

五、計(jì)算樣品活性

六、 酶標(biāo)板測(cè)定

1． 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中

3． 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）

4． 分別加入xx微升底物液（Reagent E）

5． 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板

6． 在37℃溫度下孵育3分鐘

7． 分別加入xx微升陰性液（Reagent F）或待測(cè)樣品（20微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）

8． 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板

9． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和15分鐘讀數(shù)

10． 活性計(jì)算：

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（酶標(biāo)板）操作，包括背景對(duì)照

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測(cè)定只需1次

4． 可以使用純化線粒體（10微克）作為待測(cè)樣品

5． 建議使用比色皿測(cè)定

6． 樣品須澄清，至關(guān)重要

7． 加樣后3秒內(nèi)比色測(cè)定

8． 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可持續(xù)15分鐘

9． 比色測(cè)定后，比色皿須清洗

10． 樣本測(cè)定15分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

11． 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

12． 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

13． 檸檬酸合成酶單位活性定義為：在37℃，pH 8.0條件下，每分鐘內(nèi)能夠生成1微摩爾檸檬酸所需的酶量作為一個(gè)活性單位

14． 本公司提供系列脂肪酸代謝檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感