動脈粥樣硬化斑塊主要發(fā)生在動脈的分支和彎曲處，血管內(nèi)皮細胞（ECs）暴露于低剪切應(yīng)力和振蕩剪切應(yīng)力。分叉和彎曲處的血流紊亂會促發(fā)內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)及動脈粥樣硬化的發(fā)生，擾動流上調(diào)內(nèi)皮細胞中粘附分子和趨化因子的表達，從而促進免疫細胞向內(nèi)皮細胞的遷移、浸潤和滯留。因此，靶向由血流紊亂或其他動脈粥樣硬化驅(qū)動因素誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥可對抗動脈粥樣硬化產(chǎn)生有益影響。

Yes-associated protein（YAP）和具有PDZ結(jié)合結(jié)構(gòu)域（TAZ）的轉(zhuǎn)錄共激活因子是Hippo通路的主要下游效應(yīng)因子。據(jù)報道，YAP和TAZ與機械轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，它們整合機械信號以調(diào)節(jié)不同的細胞過程。研究表明，層流剪切應(yīng)力通過整合素-Gα13-RhoA-YAP/TAZ軸抑制內(nèi)皮活化和動脈粥樣硬化。相反，據(jù)報道，振蕩剪切應(yīng)力通過整合素α5β1/c-Abl激活YAP，從而加重內(nèi)皮炎癥和動脈粥樣硬化。這些發(fā)現(xiàn)表明，YAP有望作為動脈粥樣硬化的治療靶點。因此，研究的目標(biāo)是尋找抑制YAP活性的藥物或化合物。

在香港中文大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院、香港城市大學(xué)生物醫(yī)學(xué)系課題團隊的一項研究中，將抗精神病藥物硫利達嗪（Thioridazine）確定為一種有效的YAP抑制劑。在體內(nèi)和體外實驗中，硫利達嗪抑制了紊亂血流誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，此外，硫利達嗪的給藥在兩種小鼠動脈粥樣硬化模型中發(fā)揮了抗動脈粥樣硬化作用。該研究還為硫利達嗪抑制RhoA調(diào)節(jié)YAP活性的潛在機制提供了新的見解。這項研究開辟了將硫利達嗪重新用于干預(yù)動脈粥樣硬化疾病的可能性。具體內(nèi)容發(fā)表在Acta Pharmacologica Sinica 期刊題為“Thioridazine protects against disturbed flow-induced atherosclerosis by inhibiting RhoA/YAP-mediated endothelial inflammation”。

首先，為了尋找新的YAP抑制劑，研究人員建立了一個基于熒光素酶報告基因檢測的藥物篩選平臺，通過從FDA藥物庫中篩選小分子化合物，發(fā)現(xiàn)抗精神病藥物硫利達嗪（10 μM）可抑制內(nèi)皮細胞中的YAP活性。同時，CCK-8實驗表明，10 μM的硫利達嗪對HUVECs的細胞活力沒有明顯的毒性作用，而且促進了YAPS127的磷酸化。因此將其確定為一種新的YAP抑制劑。

為了進一步探討硫利達嗪如何影響HUVECs，分離了硫利達嗪處理的HUVECS的總RNA用于RNA測序。KEGG富集分析證實硫利達嗪調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞中的Hippo通路。此外，GO和GSEA分析顯示，硫利達嗪處理與機械刺激和內(nèi)皮活化有關(guān)。GAD疾病分析顯示，差異表達基因與包括動脈粥樣硬化在內(nèi)的心血管疾病顯著相關(guān)，表明硫利達嗪可以用作一種抗動脈粥樣硬化藥物。因此，RNA-seq分析提供了硫利達嗪可能保護內(nèi)皮細胞免受生物力學(xué)刺激誘導(dǎo)的炎癥和動脈粥樣硬化形成的線索。

接下來，為了研究硫利達嗪是否抑制機械刺激誘導(dǎo)的內(nèi)皮活化，對 ApoE KO 小鼠頸動脈進行了部分結(jié)扎以誘導(dǎo)擾動流（圖1 a）。免疫熒光染色顯示，硫利達嗪抑制了暴露于擾動流的內(nèi)皮細胞中VCAM-1的表達（圖1 b）。同時，應(yīng)用平行平板系統(tǒng)來模擬體外擾動流（OSS，0.05?±?0.4?Pa，1?Hz），發(fā)現(xiàn)硫利達嗪顯著抑制OSS誘導(dǎo)的HUVECs促炎基因的表達（圖1 d），且顯著阻礙了OSS誘導(dǎo)的單核細胞與內(nèi)皮細胞的粘附（圖1 e、f）。為了進一步探討硫利達嗪是否通過抑制 YAP 抑制內(nèi)皮活化，用組成型活性 YAP （CA-YAP）轉(zhuǎn)染 HUVECs，然后施加硫利達嗪和OSS，結(jié)果表明，CA-YAP的過表達逆轉(zhuǎn)了硫利達嗪在暴露于擾動流的HUVEC中的抗炎作用。因此，硫利達嗪主要通過抑制YAP來抑制擾動流誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥。

圖1 硫利達嗪通過限制YAP活性來抑制紊亂的血流誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥。

既往研究報道，細胞外刺激（如剪切應(yīng)力）通過小GTPase RhoA調(diào)節(jié)YAP活性。上述RNA-seq數(shù)據(jù)的GO分析表明了硫利達嗪參與GTPase活性的調(diào)節(jié)。有趣的是，實驗還觀察到用硫利達嗪處理的HUEVCs的形態(tài)變化。F-肌動蛋白染色證實硫利達嗪調(diào)節(jié)細胞骨架肌動蛋白，因此，實驗假設(shè) RhoA 可能參與了硫利達嗪誘導(dǎo)的 Ser127 位點 YAP 磷酸化的上調(diào)。GST-RBD拉下試驗證實硫利達嗪抑制HUVECs中RhoA的活性，且過表達RhoA 可消除硫利達嗪誘導(dǎo)的 YAP 磷酸化。這些數(shù)據(jù)表明，硫利達嗪通過抑制 RhoA 活性來上調(diào)YAPS127 的磷酸化。

然后，為了確定硫利達嗪的體內(nèi)效應(yīng)，實驗還應(yīng)用部分結(jié)扎小鼠模型來誘導(dǎo)擾動流（圖1a、2b），將對照或硫利達嗪施用于 ApoE?/? 小鼠三周（圖2 a）。結(jié)果表明，硫利達嗪減輕了動脈粥樣硬化的發(fā)生（圖2 c）。結(jié)扎LCA的H&E和油紅O染色一致證實了硫利達嗪的抗動脈粥樣硬化作用（圖2 e-h）。此外，硫利達嗪抑制RhoA和YAP活性（圖2 i、j），還抑制ApoE?/? 小鼠主動脈中YAP靶基因和促炎標(biāo)志物的表達（圖2 k、l）。

圖2 口服硫利達嗪抑制ApoE?/? 小鼠部分結(jié)扎誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化。

最后，為了進一步研究硫利達嗪的作用，實驗使用了另一種小鼠模型，其中動脈粥樣硬化主要歸因于高膽固醇飲食引發(fā)的高脂血癥（圖3 a）。油紅O染色證實硫利達嗪延緩了ApoE?/? 小鼠主動脈斑塊的形成（圖3 b、c）。與主動脈表面染色結(jié)果一致，主動脈根部的H&E和油紅O染色顯示，與對照組相比，硫利達嗪處理減少了斑塊面積（圖3 e-h）。F4/80 免疫熒光染色表明，硫利達嗪可減少巨噬細胞向主動脈的浸潤（圖3 d）。值得注意的是，硫利達嗪不會引起脂質(zhì)譜（圖3 i）和體重的改變（圖3 j），表明硫利達嗪的抗動脈粥樣硬化作用與脂質(zhì)無關(guān)。

圖3 長期硫利達嗪處理減輕了ApoE?/?小鼠中高膽固醇飲食誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化。

圖4 將硫利達嗪重新用于抗動脈粥樣硬化治療的示意圖。通過藥物篩選，硫利達嗪被確定為一種有效的YAP抑制劑。硫利達嗪通過抑制 RhoA-YAP 軸抑制內(nèi)皮活化和動脈粥樣硬化形成。

綜上所述，該研究顯示，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的臨床藥物硫利達嗪通過RhoA-YAP信號通路抑制內(nèi)皮炎癥和動脈粥樣硬化形成。作為一種新型的YAP抑制劑，硫利達嗪在治療動脈粥樣硬化疾病方面可能需要進一步的研究和開發(fā)。

參考文獻：Jiang MC, Ding HY, Huang YH, Cheng CK, Lau CW, Xia Y, Yao XQ, Wang L, Huang Y. Thioridazine protects against disturbed flow-induced atherosclerosis by inhibiting RhoA/YAP-mediated endothelial inflammation. Acta Pharmacol Sin. 2023 Oct;44(10):1977-1988. doi: 10.1038/s41401-023-01102-w. Epub 2023 May 22. PMID: 37217602; PMCID: PMC10545737.
原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37217602/

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