弱染色或無染色

抗體濃度過低

• 嘗試增加一抗?jié)舛?/span>

• 考慮使用使用生物素化二抗的擴增系統(tǒng)

抗體不相容性

• 確保二抗與一抗的物種和抗體亞類兼容

高背景會模糊信號

• 請嘗試遵循下面本故障排除指南的“高背景或非特異性染色”部分中詳細介紹的建議。

膜被透化試劑損壞

• 嘗試使用較低濃度的清潔劑。

• 嘗試使用較弱的清潔劑（例如用 Triton X-100 代替 Tween-20）

抗體不適合 IHC

• 有些抗體不適合 IHC 中抗原的呈現方式。檢查數據表，了解之前是否已在 IHC 或 ICC 中進行過測試，如果沒有，請考慮使用不同的抗體。

• 嘗試使用不同的固定方法，該方法將以不同的方式呈現抗原，因此可能允許抗體結合。

目標蛋白豐度低

• 嘗試增加一抗?jié)舛?/span>

• 嘗試使用放大方法，例如生物素化二抗

固定可能會掩蓋目標表位

• 嘗試第 5.2 節(jié)中描述的抗原修復方法之一

抗體對組織切片的滲透性較差

• 嘗試將抗體孵育更長時間或以更高的濃度

• 嘗試使用更薄的組織切片

• 嘗試使用較小的一抗（例如使用 IgG 而不是 IgM）

通透性不足

• 嘗試增加緩沖液中 Triton-X100 的濃度。

• 如果使用 Tween-20，請考慮改用 Triton-X100，這是一種更強的清潔劑。

與檢測系統(tǒng)使用不兼容的二級熒光團

• 仔細檢查所使用的顯微鏡系統(tǒng)是否具有適合所使用熒光團的正確激發(fā)和發(fā)射濾光片。

• 考慮使用不同的熒光團偶聯二抗。幾乎所有熒光顯微鏡至少都配備濾光片組，能夠對 DAPI 和 FITC / Alexa Fluor 488 / Dylight 488 進行成像。

安裝后熒光團降解

• 免疫熒光切片封片后 2 天內對切片進行成像。

緩沖區(qū)退化

• 使用前檢查緩沖液的 pH 值

• 警惕細菌生長的跡象，一旦發(fā)現就扔掉。

• 必要時新鮮制作。

降解的一抗

• 確?？贵w在制造商提供的最佳使用日期內。

• 考慮將來分裝抗體，快速冷凍，然后儲存在 -80°C 下，以避免抗體降解的風險。

由于光漂白而損壞熒光團共軛二抗

• 確保使用熒光團共軛二抗時執(zhí)行的所有步驟都是在弱光或黑暗中進行

• 成像時盡量使用盡可能低的照明來捕獲最佳圖像。這對于共焦顯微鏡尤其重要，因為高激光功率設置可以極快地漂白一些熒光團。

• 考慮使用比 FITC 或 TRITC 等舊化合物更耐漂白的熒光團。

不兼容的緩沖區(qū)

• 一些抗體在基于 TBS 的緩沖液中表現更好，而其他抗體則更喜歡 PBS。嘗試更換緩沖液，看看這是否會增加染色。 

過度固視

• 嘗試減少組織與固定劑一起孵育的時間。

• 考慮嘗試替代固定液

多路復用時在通道之間滲透

重疊的熒光團激發(fā)/發(fā)射光譜

• 嘗試使用重疊有限的熒光團對（例如DAPI、Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 594）

• 使用光譜分析工具（例如FPbase Spectraviewer）確保熒光團對之間的重疊有限。

• 嘗試使用單一抗體對照，看看一個通道中的信號是真實的還是只是由于滲漏所致。

• 一些先進的圖像分析軟件具有可以（在一定程度上）校正滲色的功能。

成像系統(tǒng)上的激發(fā)和發(fā)射濾光片不合適

• 檢查熒光團和濾光片之間的兼容性，以確保每個濾光片僅捕獲熒光團。

• 對于共焦顯微鏡，請考慮收緊允許進入檢測器的光波長窗口并使用測序，以便每個熒光團只有一個激光處于活動狀態(tài)。

組織形態(tài)改變

冰傷害

• 確保在未來的實驗中按照既定方案（例如本文件中列出的方案）冷凍組織。將組織切片放入 30% 蔗糖中時，確保組織已全沉沒，否則蔗糖可能沒有足夠的時間擴散到組織中。

• 考慮在分析中引入損傷評分系統(tǒng)，以評估冰損傷是否影響實驗結果。 

自由浮動部分的粗暴處理

• 使用網等設備可以幫助減少整個協議中組織切片所需的處理量。

• 使用優(yōu)質細畫筆拾取和移動部分。確保沒有被低溫恒溫器/切片機刀片降解。

• 安裝自由浮動部分時，盡量避免接觸部分，而是使用刷子飄到載玻片上。

因儲存不當而降解

• 如果保存不當，切片可能會被微生物生長污染。考慮使用 0.05% 疊氮hua鈉來防止儲存溶液或冷凍切片中的生長

抗原修復過于苛刻

• 考慮將抗原修復方法改為不太苛刻的方法

冰凍切片從載玻片上脫落

• 確保始終對載玻片進行處理，以確保切片更有效地粘貼。雖然有商業(yè)品種，但可以按照CSH 協議等既定協議在實驗室中對載玻片進行替換； 

固定不佳

• 不全固定會導致組織迅速降解。嘗試增加組織與固定劑一起孵育的時間或考慮增加固定劑的濃度。

高背景或非特異性染色

組織切片中的自熒光分子

• 如果組織尚未灌注，請考慮在下一個實驗中進行，因為剩余的紅細胞會產生強烈的自發(fā)熒光。

• 自發(fā)熒光可能是由固定劑引起的。嘗試使用不同的固定劑。

• 確保 NaBH 4是新鮮制備的

• 嘗試用淬滅熒光的染料（例如，Pontamine 天藍、蘇丹黑或臺盼藍）孵育切片。

• 嘗試使用與自發(fā)熒光波長不同的熒光團（例如紅移染料，如 Alexa Fluor 680） 

非特異性二次結合

• 運行無初級對照以評估次級對照是否與組織切片結合。

• 如果一抗與組織來自同一物種，這可能會導致重大問題。請參閱本協議或考慮使用不同種類的一抗。 

一抗?jié)舛冗^高

• 嘗試降低一抗?jié)舛?/span>

二抗?jié)舛冗^高

• 嘗試降低二抗的濃度。我們發(fā)現 1:300 至 1:500 的稀釋度是一個不錯的起點。

抗體純化不充分

• 未純化的多克隆抗體可能含有與一系列非靶蛋白發(fā)生交叉反應的抗體。檢查數據表；理想情況下，應使用免疫原作為誘餌，通過親和層析純化多克隆抗體。 

• 雖然單克隆抗體的問題較少見，但仍應至少使用 Protein A 或 G 親和層析進行純化。

• 如果有其他替代品，請考慮改用更好的純化抗體，或者如果沒有其他替代品，請考慮內部純化抗體。  

阻擋不足

• 確保封閉血清與培養(yǎng)二抗的物種相同。

• 嘗試使用不同的阻塞解決方案。

• 嘗試增加封閉步驟的長度或增加血清濃度

洗滌不足

• 嘗試增加洗滌的時間和/或次數。

• 確保洗滌期間有足夠的攪拌，以幫助未結合的抗體擴散出組織

一抗與組織切片來自同一物種。

• 運行無初級對照以評估次級對照是否與組織切片結合。

• 如果一抗與組織來自同一物種，這可能會導致重大問題。請參閱本協議第 4.3 節(jié)或考慮使用不同種類的一抗。

內源酶活性（用于顯色檢測）

• 嘗試用特定抑制劑阻斷內源酶活性。

對于 HRP 結合二抗，使用 0.3% H 2 O 2 10-15 分鐘。如果在此濃度下封閉不成功，請考慮增加至 3%。 

對于 AP 結合二抗，請使用 2mM 左旋咪唑。 

部分已經干了

• 確保切片始終保持濕潤，并在加濕室中使用載玻片安裝方案進行長時間孵育。

底物過多（用于顯色檢測）

• 嘗試降低底物濃度或孵育時間。

信號放大率過高（如果使用生物素化二抗）

• 嘗試降低擴增試劑或二抗的濃度。

• 考慮信號放大是否必要或者標準方法是否有效。

組織切片厚度

• 組織切片越厚，寬視野顯微鏡中的散射光越多。嘗試使用更薄的開關部分或共焦顯微鏡。