隨著生物醫(yī)藥行業(yè)的蓬勃發(fā)展，利用生物技術(shù)制備的產(chǎn)品安全性更加備受關(guān)注，其中宿主核酸的控制與去除是至關(guān)重要的。一般的生物制品使用全能核酸酶即可去除宿主核酸，但一些廣泛應(yīng)用于基因及細(xì)胞治療領(lǐng)域的生物制品制備和純化工藝需要在較高鹽濃度進(jìn)行，需要高鹽條件下具有高活性的核酸酶。上海逐典成功開發(fā)的耐鹽核酸酶產(chǎn)品，在600-700mM時(shí)仍保持較活性，可以更高效、低成本的去除宿主核酸。

一，宿主DNA殘留控制的法規(guī)要求

生物制品在生產(chǎn)過(guò)程中通常會(huì)使用工程細(xì)胞（菌）作為宿主。宿主的核酸殘留，特別是DNA殘留會(huì)引入免疫原性、致瘤性、感染性、干擾代謝等潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)，因此各國(guó)藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)對(duì)生物制品的宿主核酸殘留量都有著嚴(yán)格的限度控制。

各國(guó)法規(guī)對(duì)不同生物制品的宿主核酸殘留控制限度要求不同，殘留量一般控制在0.1-10ng/劑，如有殘留片段大小的限制要求，一般控制在200 bp以下。如《中國(guó)藥典》（2020版）規(guī)定，疫苗類宿主DNA殘留一般控制應(yīng)在0.05-10ng/劑?！扼w內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中建議：“如有可能，建議盡量將殘留DNA控制在10ng/劑以內(nèi)，DNA殘留片段的大小控制在200bp以下。”美國(guó)FDA頒布的《Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)》中要求宿主DNA殘留需控制在低于10ng/劑，并且DNA大小需小于200 bp。

二，《中國(guó)藥典》（2020版）部分生物制品殘留DNA限度要求

三，宿主DNA殘留控制面臨的挑戰(zhàn)

來(lái)源于粘滯沙雷氏菌的非特異性核酸酶，如SuperNuclease等，已廣泛應(yīng)用于上市藥品生產(chǎn)過(guò)程中的宿主核酸控制。雖然在生理鹽條件下的體外水解實(shí)驗(yàn)中，這類酶可以迅速水解魚精DNA或小牛胸腺DNA，生成小于8nt的寡核苷酸產(chǎn)物，但是在復(fù)雜的工藝條件下使用仍面臨著眾多挑戰(zhàn)。例如：

*宿主DNA通常以染色質(zhì)的形式存在，且被包裹于含有宿主細(xì)胞碎片的復(fù)雜基質(zhì)中，有時(shí)需要在高于生理鹽濃度的鹽離子中才能使DNA和蛋白質(zhì)有效分離。

*AAV等一些病毒載體易發(fā)生聚集，在低鹽條件下穩(wěn)定性差，需要在中、高鹽的緩沖液中才能保證其活性。因此需要核酸酶在中、高鹽的條件下具有高活性，保證病毒載體的回收率。

*在純化工藝環(huán)節(jié)中，如利用高鹽洗脫的層析樣品中的宿主細(xì)胞核酸含量偏高，需要采取相應(yīng)措施降低宿主核酸含量。

除此之外，傳統(tǒng)核酸酶的活性會(huì)隨著鹽濃度升高而急劇下降，在中、高鹽條件使用這類核酸酶會(huì)造成生產(chǎn)成本顯著增加。

四，逐典耐高鹽全能核酸酶優(yōu)勢(shì)

1.更高鹽耐受度

當(dāng)鹽離子濃度在600~700mM時(shí)，初代全能核酸酶幾近失活，而SAN仍能保持較高活性。

圖1.不同鹽濃度下耐高鹽全能核酸酶(SAN)與初代全能核酸酶活性對(duì)比

2. 高效核酸降解力

同對(duì)照組相比，添加SAN后能夠有效去除核酸殘留。

圖2 加入SAN 前后的消化效果圖

五，逐典耐高鹽全能核酸酶用途

1.疫苗和病毒樣品制備中高鹽環(huán)境下DNA污染的去除

2.與細(xì)胞或細(xì)菌裂解液配合使用，去除粗提物中的核酸，降低溶液粘性，提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量。

3.減少存放的外周血單細(xì)胞(PBMC)的結(jié)塊現(xiàn)象

4.降解核酸，利于不可溶性蛋白復(fù)性前高質(zhì)量包涵體制備。

5.有效去除帶負(fù)電荷的核酸對(duì)雙向SDS-PAGE蛋白樣品的影響，改善蛋白質(zhì)分離效果，增強(qiáng)2-DE分辨率

六，客戶應(yīng)用案例