β-木糖苷酶活性檢測試劑盒（微量法）

產(chǎn)品貨號：BA1028

產(chǎn)品規(guī)格：100管/48樣

產(chǎn)品內(nèi)容：

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前加入1mL蒸餾水。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：5μmol/mL對硝基苯酚溶液。

產(chǎn)品說明：

β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)存在于植物、細(xì)菌和真菌等生物體，是催化木聚糖類半纖維素降解的關(guān)鍵酶，產(chǎn)物木糖可作為碳源應(yīng)用于微生物發(fā)酵。另外，β-木糖苷酶還可以作為生物漂白劑應(yīng)用于造紙工業(yè)，比傳統(tǒng)的漂白法環(huán)保，具有廣泛的應(yīng)用價值。

β-木糖苷酶催化對硝基苯酚-β-D-木糖苷產(chǎn)生對硝基苯酚，對硝基苯酚在405nm處有特征吸收峰， 測定405nm光吸收增加速率，可計算β-木糖苷酶活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者 增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

天平、低溫離心機(jī)、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、水浴鍋、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 植物樣本：稱取約0.1g樣品，加1.0 mL提取液充分冰浴勻漿，然后12000rpm，4℃，離心20min，棄沉淀，取20μL上清測定蛋白含量，剩余上清作為待測酶液。

2. 細(xì)菌、真菌樣本：收集約500萬個細(xì)胞，加入1.0 mL提取液，超聲波破碎（冰浴，功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000rpm，4℃，離心10min，棄沉淀 ，取20μL上清測定蛋白含量，剩余上清置于冰上待測。

二、測定操作表 

1. 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至405nm，對照管調(diào)零。

2. 標(biāo)準(zhǔn)液的處理：用試劑二將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋至0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625μmol/mL。

3. 樣本測定： 

三、β-木糖苷酶活性計算 

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（x）和濃度（y，μmol/mL）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測定帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計算樣本生成的產(chǎn)物量y（μmol/mL）。

1. 按樣本蛋白含量計算：

酶活定義：45℃，pH7.4時，每毫克蛋白質(zhì)1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。

β-木糖苷酶活性（U/ mg prot）=(y×V樣)÷(V樣×Cpr)÷T=0.05×y÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計算：

酶活定義：45℃，pH7.4時，每克樣本1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。

β-木糖苷酶活性（U/g 質(zhì)量）＝(y×V樣)÷(W×V樣÷V樣總)÷T=0.05×y÷W

3. 按細(xì)胞數(shù)量計算：

酶活定義：45℃，pH7.4時，每10⁴個細(xì)胞1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。

β-木糖苷酶活性（U /10⁴cell）= (y×V樣)÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.0001×y

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；0.2mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬；T：反應(yīng)時間，20min。

注意事項：

1. 吸光度變化應(yīng)該控制在0.05-0.6之間。否則加大樣品量或稀釋樣品，注意計算公式中參與計算的稀釋倍數(shù)要相應(yīng)改變。

2. 樣品蛋白質(zhì)含量需要另外測定，可選用考馬斯亮藍(lán)法蛋白含量測定試劑盒進(jìn)行測定。