介紹

這篇博客文章的目的是為Simoa®用戶提供有效的資源，用于檢測下限（LOD）和定量下限（LLOQ）的常見分析驗證。確定檢測和定量下限的方法在復(fù)雜性上有所不同，這取決于測定開發(fā)階段和適用的法規(guī)。例如，在早期開發(fā)中，通過簡單地插值校準(zhǔn)曲線來近似LOD可能就足夠了，但對于最終驗證，可能需要使用真實樣本進(jìn)行更深入的實驗和統(tǒng)計方法。

指導(dǎo)方針

臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI）專門為診斷免疫測定驗證提供了一些具參考價值的指南。這些指南發(fā)表在一系列文件中，如CLSI EP17——臨床實驗室測量程序檢測能力評估，第2版。除了CLSI指南外，歐洲藥品管理局在其ICH Q2（R2）分析程序驗證——科學(xué)指南文件中提供了另一套有價值的指南，用于驗證各種分析方法，不限于免疫測定。本指南主要側(cè)重于藥品質(zhì)量控制中使用的分析方法。

檢測極限和定量極限的估計

CLSI指南使用三種檢測質(zhì)量屬性來接近檢測能力：空白限度（Limit of Blank LOB）、檢測限度（Limit of Detection LOD）和定量限度（ Limit of Quantitation LOQ）。

LOB：當(dāng)對不含分析物的樣品進(jìn)行重復(fù)測試時，預(yù)計會發(fā)現(xiàn)的最高表觀分析物濃度。

LOD：可與LOB可靠區(qū)分的低分析物濃度，在該濃度下檢測是可行的。

LOQ：分析物不僅可以可靠檢測，而且可以達(dá)到某些預(yù)定義目標(biāo)（即精度和偏差）的低濃度。

高靈敏度測定的特征在于低LOD；然而，低LOB也是實現(xiàn)低LOD所必需的。在任何免疫測定中，由于非特異性結(jié)合（例如，檢測抗體與捕獲表面和/或抗體之間的弱相互作用），都會有固有的背景信號，但可以采取步驟將其最小化。在Simoa®開發(fā)Homebrew時，我們通常建議將空白信號的目標(biāo)定為每珠平均酶數(shù)0.005–0.05（AEB）。然而，了解空白樣品和低濃度樣品的可變性是評估測定檢測能力的關(guān)鍵。根據(jù)CLSI EP17指南，含有LOD分析物的樣品應(yīng)在95%的時間內(nèi)與LOB區(qū)分開來。

設(shè)計實驗以評估檢測要考慮的變量包括要測試的試劑盒批次數(shù)量、操作員數(shù)量（如果使用手動步驟的儀器，如SR-X）、天數(shù)（分析批間變異性）、要測試的不同空白樣品/低濃度樣品數(shù)量，以及要測試的空白/低濃度樣本的總重復(fù)次數(shù)。根據(jù)定義，LLOQ必須等于或大于LOD。LLOQ的確定與LOD的不同之處在于，還需要滿足精度和偏差的預(yù)定義目標(biāo)。通常，精密度的目標(biāo)是將產(chǎn)生20%或更低的濃度變異系數(shù)（CV）的低分析物濃度。可以使用各種方法來確定LLOQ，Quanterix使用的三種方法在客戶門戶網(wǎng)站上的技術(shù)說明中有描述（TECH-0034；定量下限）。4PL方法開發(fā)工具（也在客戶門戶網(wǎng)站上）使用一種稱為CV分析的方法，根據(jù)校準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)估計LLOQ。電子表格不是為用戶設(shè)計的驗證工具（因此計算是隱藏/鎖定的），但它可以是早期分析開發(fā)中的有用工具，也可以用來表征正在開發(fā)或測試的分析的性能。