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細(xì)胞計數(shù)的實驗步驟&問題分析

來源:深圳市安培生物科技有限公司   2024年04月25日 13:55  

細(xì)胞計數(shù)在細(xì)胞實驗中是非常常見的,大多數(shù)實驗室目前使用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),細(xì)胞計數(shù)板的結(jié)構(gòu)如下圖所示:

細(xì)胞計數(shù)的實驗步驟&問題分析

實驗步驟

1.所用細(xì)胞密度達(dá)到一定要求后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)鋪板,提前準(zhǔn)備好細(xì)胞計數(shù)板、蓋玻片、計數(shù)器;

2.棄掉原有培養(yǎng)基,加入1ml溫浴的PBS緩沖液清洗;

3.棄掉PBS緩沖液,加入胰酶消化細(xì)胞,消化時間根據(jù)細(xì)胞類型及日常經(jīng)驗決定;

4.消化相應(yīng)時間后,加入二倍體積的培養(yǎng)基終止消化,用移液器將細(xì)胞全部吹下,轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi);

5.離心機(jī)室溫800rpm,離心5min;

6.準(zhǔn)備和所計數(shù)細(xì)胞種類相同的1.5ml Ep管,各加入PBS緩沖液980ul備用;

7.準(zhǔn)備細(xì)胞計數(shù)板,并在計數(shù)區(qū)蓋上蓋玻片;

8.將5中離心結(jié)束的細(xì)胞棄上清,加入1ml培養(yǎng)基,充分混懸后取20ul加入到6中的Ep管中,充分顛倒混勻后取12ul加入牛鮑計數(shù)板一側(cè)的計數(shù)區(qū)內(nèi),保證計數(shù)區(qū)充盈。

9.低倍顯微鏡(物鏡4)下找到計數(shù)視野,上圖中“”B C D E“”區(qū)為細(xì)胞計數(shù)區(qū)。

10.高倍鏡(物鏡10)下計數(shù)細(xì)胞,依次計數(shù)4個方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量。

11.計算細(xì)胞數(shù)量,假設(shè)4個方格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)為A,則每ml的細(xì)胞數(shù)量為:A/4×104×50(稀釋倍數(shù))=B個。

12.假設(shè)鋪板所需細(xì)胞密度為1×104個/ml,則所需8中的細(xì)胞混懸液的量為:1×104×C(培養(yǎng)基所需毫升數(shù),如6孔板每孔加培養(yǎng)基2ml)/B=D ml,最后換算成μl即可。

13.鋪板:取C ml培養(yǎng)基,加入8中細(xì)胞混懸液D μl,充分混勻后依次加入培養(yǎng)皿中,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)即可。

細(xì)胞計數(shù)的實驗步驟&問題分析

常見問題及注意事項
1.鏡下計數(shù)細(xì)胞時,壓線細(xì)胞按照“計上不計下,計左不計右”的原則進(jìn)行,若有少量成團(tuán)細(xì)胞,則按1個細(xì)胞處理,若成團(tuán)細(xì)胞太多,說明在步驟8中,細(xì)胞不全部混懸,未能所有都分開成單細(xì)胞,因此需重新進(jìn)行上述步驟。
2.需要鋪板的細(xì)胞長滿時數(shù)量較多,因此計數(shù)時稀釋倍數(shù)盡量大,取混懸液的每一步保證細(xì)胞充分混勻,計數(shù)結(jié)果更為準(zhǔn)確。
3.鏡下計數(shù)細(xì)胞時,最少計數(shù)兩次,取平均值為最終結(jié)果。

4.細(xì)胞混懸液加入細(xì)胞計數(shù)板時,建議使用10μl小槍頭、2-20μl移液器,槍頭傾斜抵住蓋玻片邊緣,緩慢加入,務(wù)必保證細(xì)胞混懸液全部加入,計數(shù)區(qū)充盈。

關(guān)于細(xì)胞計數(shù),以如下實例來充分理解上述計算過程:

1.假設(shè)實驗要求最后鋪板密度為1×105個/ml,計劃以6孔板鋪板,擬使用4個孔,每孔2ml培養(yǎng)基,則所需細(xì)胞總數(shù)為:1×105×2ml×5孔=1×106個。
2.假設(shè)4孔細(xì)胞總數(shù)為100個,則細(xì)胞密度為:100/4×104×50(稀釋倍數(shù))=1.25×107個/ml。
3.最終所需細(xì)胞懸液量為:1×106/1.25×107=0.08ml=800μl

4.鋪板:培養(yǎng)基5孔(為防止不夠所以多準(zhǔn)備1孔)2ml×5孔=10ml加入細(xì)胞混懸液800μl,混勻加入六孔板即可。

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