一，基本概念

報(bào)告基因：基因表達(dá)變化或者與基因表達(dá)變化相關(guān)的細(xì)胞事件的一個(gè)指示劑。通常是一種編碼易被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定。

熒光素酶（luciferase）：一類能夠產(chǎn)生生物發(fā)光信號的酶的統(tǒng)稱，其中最有代表性的是從甲蟲中分離得到的螢火蟲熒光素酶和從海腎中分離得到的海腎熒光素酶。螢光素酶可以催化自身底物氧化，反應(yīng)中一部分能量以光子形式被釋放，即生物發(fā)光信號。螢光素酶是理想的報(bào)告基因，因?yàn)椴溉閯游锛?xì)胞中不含內(nèi)源性螢光素酶，一旦轉(zhuǎn)錄完成立刻就生成功能性的螢光素酶，同時(shí)在所有的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中，它的光產(chǎn)物具有最高的量子效率，檢測靈敏度高。

二，熒光素酶促進(jìn)生物發(fā)光的機(jī)制

以螢火蟲螢光素酶的生物發(fā)光反應(yīng)為例（主報(bào)告基因）：

螢光素酶是一種作為化學(xué)反應(yīng)催化劑的蛋白質(zhì)，能在螢光素、ATP和其它細(xì)胞離子存在的條件下促進(jìn)光的產(chǎn)生?；瘜W(xué)反應(yīng)本身包括兩個(gè)步驟：

1. 在螢光素酶存在的條件下，螢光素+ATP生成螢光素化腺苷酸+ ADP。

2. 將螢光素化腺苷酸+氧氣轉(zhuǎn)化為氧化螢光素+AMP以及光。

螢火蟲熒光素酶一般是作為主報(bào)告基因，將目的基因構(gòu)建在該載體上，從而反應(yīng)目的序列的作用結(jié)果，因此根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，可以針對此質(zhì)粒進(jìn)行改造，載體的工作原理如下圖所示：

海腎熒光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)需要腔腸素和O2的參與，發(fā)光顏色為藍(lán)色。

海腎熒光素酶通常作為內(nèi)參報(bào)告基因，來標(biāo)定檢測用報(bào)告基因的測量結(jié)果，從而達(dá)到有效地減少實(shí)驗(yàn)誤差的目的，載體的工作原理如右圖所示：

三，實(shí)驗(yàn)方法

1. 用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（若目標(biāo)是檢測miRNA 及其靶基因的靶向作用，則需要預(yù)測兩者結(jié)合位點(diǎn)）。
2. 設(shè)計(jì)引物用 PCR 法從基因組 DNA 中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（如 pGL3-basic）中。

3. 克隆報(bào)告基因載體：質(zhì)粒的提取、轉(zhuǎn)化。

4. 工具細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：293T細(xì)胞。

細(xì)胞培養(yǎng)：生長 90%匯合的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞鋪板：取對數(shù)生長期的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，接種于 96-well 培養(yǎng)板中。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到約 60%。

瞬轉(zhuǎn)24h；給藥24h。（瞬時(shí)轉(zhuǎn)染（Transient Transfection）與雙螢光素酶報(bào)告基因檢測；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（StableTransfection）與單螢光素酶報(bào)告基因檢測）

5. 實(shí)驗(yàn)室用報(bào)告基因檢測方法：

1)用1ml注射器棄去96孔板中的培養(yǎng)基

2)取Reporter lysis 5×Buffer 裂解液，稀釋5倍（1.5ml+6ml純水），混勻

3)用排槍+ 100 μl/孔

4)搖床上震蕩30min

5)洗凈白板（全白色不透光平板（White Plates, Solid Bottom）、吹干，排槍吸取50μl/孔加至白板中

6)配底物：1ml+2.5ml純水，注意避光

7)避光用排槍+底物50μl/孔

8)立即用酶標(biāo)儀檢測（特異生物學(xué)反饋+非特異生物學(xué)反饋）

• 發(fā)光檢測儀（Luminometer），或者帶有發(fā)光檢測模塊（使用化學(xué)發(fā)光，無需設(shè)置波長）

6. β-半乳糖苷酶檢測（β-Gal）（內(nèi)參）

（報(bào)告基因A檢測剩下在原96孔板中的用作β-Gal檢測）

1)原96孔板中+ β-Gal檢測試劑50ul/孔

2)蓋上蓋子用保鮮膜封住防止蒸發(fā)，輕拍混勻，放于37℃敷箱30min，樣品孔會呈淺黃色

3)+150ul/孔β-半乳糖苷酶反應(yīng)終止液，混勻

4)分光光度計(jì)檢測420nm處波長（非特異生物學(xué)反饋）

7. 數(shù)據(jù)處理：

主報(bào)告基因與內(nèi)參基因的相對活性比值作為相對光強(qiáng)度RLU，再作歸一化處理。

CHASELECTION逐典螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒旨在準(zhǔn)確、靈敏、高效地測定螢火蟲螢光素酶活性，應(yīng)用高通量藥物篩選、藥物活性檢測、大規(guī)模啟動子功能測定、信號通路等研究。

逐典螢光素酶報(bào)告基因

針對報(bào)告基因檢測不同的側(cè)重需求，逐典推出了3種檢測系統(tǒng)。

逐典螢光素酶報(bào)告基因優(yōu)勢：

1. 檢測靈敏度高，信號穩(wěn)定性好

HEK293-NFK B-LUC細(xì)胞加入梯度稀釋的TNF 在37C、5%CO條件下刺激6小時(shí)后,分別用增強(qiáng)型、超敏型、穩(wěn)定型檢測試劑進(jìn)行信號檢測。

2. 操作方便

僅需將底物和螢光素酶檢測緩沖液混合后直接加入到細(xì)胞即可。

3. 穩(wěn)定性好

同時(shí)在10次反復(fù)凍融實(shí)驗(yàn)中，逐典全系列報(bào)告基因檢測試劑盒顯示出較強(qiáng)的穩(wěn)定性。