microRNA(miRNA)是一種長度約為19-25nt單鏈RNA，一般參與轉錄后調節(jié)基因表達。作為非編碼RNA（ncRNA），目前大量的研究顯示一些差異表達miRNA在眾多的疾病中扮演著重要的角色，而了解miRNA差異表達，熒光定量PCR是最基礎、應用最多的檢測和定量miRNA的方法。

由于miRNA的長度比較短，因此傳統(tǒng)的熒光定量并不適用，下面介紹的兩種方法的最根本的原理其實就是延長miRNA.因此在這里分享了關于miRNA進行qPCR的兩種方法和一些經(jīng)驗總結：

一、提取細胞、血清或外泌體RNA

就目前而言，針對不同樣品TRIZOL法提取RNA是比較通用的提取RNA的試劑，但是也具有相應的提取試劑盒（血清RNA提取試劑盒），目前一般均使用的是TRIZOL法提取的total RNA進行后續(xù)實驗，但有文獻說明TRIZOL法可能會導致miRNA丟失，也可選擇miRNA提取試劑盒。

二、miRNA的qPCR

1.miRNA莖環(huán)法逆轉錄 + miRNA熒光定量PCR

原理：在逆轉錄過程中我們需要設計一個莖環(huán)引物與我們miRNA序列結合起到延長miRNA的作用。而莖環(huán)引物是一個長度約為45bp且能夠自身環(huán)化的引物。每一個miRNA都具有自己特異的莖環(huán)引物。這最重要的原因就是設計的莖環(huán)引物中包含一段與miRNA互補序列有關：莖環(huán)逆轉錄引物 =5’端的莖環(huán)序列+3’端的miRNA的特定互補序列。

①莖環(huán)引物的設計：

首先我們在miRBase數(shù)據(jù)庫中查詢到miRNA的成熟序列(5’-3’)，利用excel中的替換功能將序列中的U全部換成T，一般地通用的莖環(huán)引物序列如CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGC3’ 或者5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC3’，紅色部分的序列可形成自身環(huán)化。

另外，針對特定miRNA設計的莖環(huán)引物：只需要在通用莖環(huán)引物3’端加上miRNA的成熟序列中的U更換成T后的序列3’端開始數(shù)6-8個堿基（一般選擇6個）的反向互補序列加在莖環(huán)通用序列的3’端即可，這樣就得到某個miRNA的莖環(huán)引物。

以hsa-miR-30b-5p為例，其成熟序列為UGUAAACAUCCUACACUCAGCU，U全部換成T：TGTAAACATCCTACACTCAGCT；則其莖環(huán)引物為：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCTGA-3′

②逆轉錄（RT）：去除基因組DNA + 逆轉錄（可使用miRNA專用的莖環(huán)法逆轉錄試劑盒）

1）去基因組DNA（2ul基因組去除試劑）；

2）RNA體積：根據(jù)提取RNA濃度來定+free-RNase H2O(to 10ul);

3)吹打混勻，42度反應2min；

4)逆轉錄：1ul莖環(huán)引物（stem-loop）+試劑盒中逆轉錄MIX（2ul+2ul）+free-RNase H2O（5ul）(to 20 ul)

5)一般來說，一次逆轉錄只能進行一個miRNA的單獨逆轉錄，但是根據(jù)實際情況而言，我們可以將miRNA+內(nèi)參U6混合在一管中一同逆轉成cDNA。

根據(jù)以上試劑盒設計的加樣量，我嘗試過一管內(nèi)混合逆轉錄內(nèi)參+5個miRNA，其中主要的變化就是在第一步增大所加入RNA的量，在第二步加莖環(huán)引物時，我們可以將所加入的free-RNase H2O（5ul）替換成不同的莖環(huán)引物(5個)，這種方式在特異性的基礎上又比較高效的合成多個miRNA，雖然節(jié)省試劑，但是也存在弊端，例如我們加入Mix(包含酶或dNTP等)都是一定量的，加入過多的莖環(huán)引物合成最終的各種miRNA的cDNA產(chǎn)物可能存在濃度過低，混合不勻可能會影響后續(xù)的熒光定量。

③熒光定量（qPCR）

5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCTGA-3′，則通用反向引物為：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′

2)熒光定量：10ul體系（20ul體系減半）(SYBR染料法)：

5ulSYBR+1ulcDNA+2ulfree-RNase H2O+2ul正反引物（提前混合）

例如：RT-qPCR分析hsa-miR-30b-5p的差異表達水平，以U6為內(nèi)參：

對照組+處理組：此時為了減小誤差bar的大小做4個復孔，以八聯(lián)管為例：

以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎點擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術與產(chǎn)品資訊。

安培生物致力成為推動生命科學進步值得信賴的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術實力、先進的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O在廣東，服務面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術服務與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務。本公司建立了涵蓋分子生物學、細胞生物學、免疫學、信號傳導和神經(jīng)科學等領域的產(chǎn)品供應線，在各個領域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品、技術支持與服務。

可以在第一時間為用戶提供比較先進的專業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務。 專業(yè)的技術力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產(chǎn)品推薦給國內(nèi)從事生物學領域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產(chǎn)品供應商，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨，配合優(yōu)秀的銷售隊伍以及專業(yè)的技術支持，隨時為客戶提供服務。