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流式細胞術(shù)的常用樣品制備方法

來源:上海源葉生物科技有限公司   2012年02月25日 11:23  

  流式細胞術(shù)的實驗檢測對象是單細胞懸液,因此,在組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)實驗中欲對待測樣品細胞進行分類計數(shù),也需把樣品制備成細胞懸液,并要求被檢細胞大小為0.2~80pm,每個樣品中至少有20 000個細胞,細胞濃度為105~107個/ml。制備成的單細胞懸液經(jīng)熒光或免疫熒光標(biāo)記即可上機檢測。

 
    1.單層培養(yǎng)細胞單細胞懸液的制備
    (1)棄去培養(yǎng)細胞(對數(shù)生長期)中的舊培養(yǎng)液,加入1~2ml 0.25%胰蛋白酶,倒置顯微鏡下觀察,見細胞稍變圓時,停止胰蛋白酶作用。也可直接觀察培養(yǎng)瓶,靜置消化2~3分鐘,待細胞逐漸變白,有脫落趨勢時,立即豎立培養(yǎng)瓶,停止胰蛋白酶作用,棄去胰蛋白酶;
    (2)加入3~4ml無鈣離子和鎂離子的PBS液,用吸管反復(fù)吹打,使其分散為單個細胞懸液,移人離心管中;
    (3)離心,去掉上清液,加入約0.5mlPBS液,用振蕩器使細胞分散;
    (4)用細滴管或注射器將細胞迅速注入4℃ 70%乙醇中,保存于4℃冰箱中備用。
 
    2.實體組織單細胞懸液的制備
    (1)機械法
    1)用剪刀剪碎或者用鋒利的解剖刀剁碎組織;
    2)將剪碎的組織加入勻漿器中勻漿;
    3)用吸管或注射器抽吸細胞懸液,以分散細胞;
    將細胞懸液在尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)上過濾,濾出的細胞懸液細胞計數(shù)后即可使用。
    (2)酶處理法  此法是實體組織分散為單個細胞的主要方法。由于不同酶對細胞內(nèi)和細胞間不同組分有特異消化作用,所以應(yīng)根據(jù)所用組織類型確定使用酶的種類。此外,乙二胺四乙酸(EDTA)能結(jié)合組織中的二價鈣離子和鎂離子,而二價鈣離子和鎂離子有維持細胞表面完整性和維持細胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用,因此,幾種酶和EDTA聯(lián)合使用有助于充分消化實體組織,提高細胞產(chǎn)出效率。下面僅介紹組織消化的一般過程,對于每種組織消化時所用的具體步驟需參考該組織細胞培養(yǎng)時的消化方法。
    1)將組織剪成l~2mm3左右的小塊。
    2)用胰蛋白酶或膠原酶消化組織塊,胰蛋白酶適用于消化細胞間質(zhì)較少的軟組織,如胚胎、上皮、肝、腎等組織。胰蛋白酶工作濃度一般為0.1%~0.5%。對于纖維較多的組織或較硬的癌組織常用0.25%膠原酶,膠原酶對組織中膠原蛋白類結(jié)構(gòu)消化作用強,它僅對細胞間質(zhì)有消化作用而對上皮細胞影響不大。膠原酶常用劑量為0.1~0.3ug/m1。用大于組織量30~50倍的胰蛋白酶液或膠原酶液在37℃條件下消化組織,需每隔一定時間搖動一次。消化時間的長短依組織類型而定,一般來說,胰蛋白酶需作用20~60分鐘,膠原酶需4~48小時。在消化過程中,如發(fā)現(xiàn)組織塊已分散而失去塊的形狀,經(jīng)搖動即可成為絮狀懸液,則可取出少量液體在顯微鏡下觀察,可見分散的單個細胞和少量的細胞團,可認(rèn)為組織已消化充分。
    3)消化完畢后,將細胞懸液通過100目孔徑尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)濾過,以除掉未充分消化的組織。
    4)已過濾的細胞懸液經(jīng)800~1000rpm低速離心5~10分鐘后,棄上清液,加PBS液,輕輕吹打形成細胞懸液,細胞計數(shù)后即可使用。
 
    3.石蠟包埋組織的流式細胞樣品制備  外科手術(shù)獲得的新鮮實體組織,往往已進行石蠟包埋處理,如果再制成細胞懸液進行流式細胞分析,需將石蠟包埋組織進行以下步驟的處理:
    (1)將石蠟包埋的組織塊切成30/xm厚的切片,盡可能除去切片中石蠟成分;
    (2)將切片置于離心管中,用二甲苯脫蠟2次,10分鐘/次;
    (3)蒸餾水洗2次后,加入lml l%胃蛋白酶溶液中(pH 1.5),37℃恒溫振蕩水浴中消化30分鐘;   
    (4)離心,所獲得的細胞沉淀可進行染色和流式細胞術(shù)分析。

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