ELISA實驗——原理、步驟

一、實驗目的

1. 檢測生物樣品中抗體、抗原、蛋白質(zhì)和糖蛋白等物質(zhì)的含量。

2. 藥物藥效學評價、篩選。

二、ELISA實驗原理

免疫吸附測定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）是免疫學和分子生物學中廣泛使用的實驗室技術(shù)，

由Eva Engvall和 Peter Perlmann 于1971年描述。

這一方法的基本原理是：

①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。

②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本

（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的

抗原抗體復合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，

底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應的深淺刊物定性或定量分析

。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度

三、ELISA實驗步驟

1. 樣品準備

a. 細胞上清樣品，需將培養(yǎng)瓶內(nèi)的細胞消化離心取上清即可（如800g，5分鐘）。

b. 血清樣品，將全血收集至不含抗凝劑的試管內(nèi)，在室溫下放置1小時，待全血自然凝固并析出血清后，4℃約1500g離心10分鐘

，取黃色上清即得血清。

c. 血漿樣品，將全血收集至含抗凝劑的試管內(nèi)，混勻后置冰上，4℃約1500g離心10分鐘，取黃色或淡黃色上清即得血漿。

2. 確定樣品測試組、標準品和空白組組所需的微孔條數(shù)量，每個濃度做兩個平行重復，從支架上取出對應數(shù)量的微孔條，剩余儲存在

箔袋中，密封后在4℃儲存。

3. 配制對應濃度的捕獲抗體溶液、檢測抗體溶液、包被液、洗滌液、樣品稀釋液、顯色液、終止液、鏈霉親和素-HRP

（若使用試劑盒則沒有此步驟或按試劑盒要求配制）。

4. 每孔加入100μL 捕獲抗體溶液，用封板膜覆蓋，4℃孵育過夜，過夜后舍棄舍板內(nèi)溶液。

5. 每孔加入300-400μL洗滌液清洗五次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干（若使用試劑盒則沒有步驟4和5）。

6. 用樣品稀釋液按照1:5, 1:10, 1:50, 1:100, 1:1000, 1:2000稀釋樣品，以此確定樣品IL-2的最佳檢測濃度。

7. 配制梯度濃度的IL-2蛋白標準品，將工作濃度設置為1200pg/mL, 600pg/mL, 300pg/mL, 150pg/mL, 75pg/mL, 37.5pg/mL,

18.75pg/mL，9.38pg/mL，以此濃度來繪制標準曲線。

8. 分別將樣品、標準品、樣品稀釋液按照100μL/孔加入相應孔中作為標測試組、標準品組、空白組。

9. 將偶聯(lián)生物素的抗人IL-2抗體按照50μL/孔加入所有孔中，用封板膜覆蓋，室溫避光孵育2小時。

10. 每孔加入300-400μL洗滌液洗板五次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。

11. 在所有孔加入100μL稀釋后的鏈霉親和素-HRP，用封板膜覆蓋，室溫避光孵育1小時。

12. 每孔加入300-400μL洗滌液洗板五次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。

13. 在所有孔中加入100μL TMB顯色液。用封板膜覆蓋，室溫避光孵育30min。

14. 在所有孔中加入終止液50μL，混勻后立即測量A450值。

15. 計算每一組重復的標準品和樣品的平均吸光度值。重復次數(shù)應在平均值的20%以內(nèi)。

16. 繪制IL-2標準品標準曲線。以標準品濃度為橫坐標，A450值為縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。

通過樣品的吸光度值和標準曲線計算出樣品的相應濃度。