細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用讓我們對(duì)生命的奧秘有了更深一步的理解，同時(shí)也為醫(yī)學(xué)研究和臨床治療提供了重要支持。無論是研究者還是醫(yī)生，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的掌握都是至關(guān)重要的，它們將開啟更多關(guān)于生命的精彩探索之旅。讓我們一起走進(jìn)細(xì)胞的微觀世界，探尋其中的無限可能吧！

01 細(xì)胞復(fù)蘇和傳代 

1.1細(xì)胞復(fù)蘇

將凍存細(xì)胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動(dòng)促進(jìn)其融化。移入15ml離心管中，加入8ml預(yù)熱的1640wan全培養(yǎng)基，輕輕吹勻，離心，1000rpmX5min，棄上清液。加入8ml 1640培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入10ml 1640wan全培養(yǎng)基，輕輕吹打，接種于T25培養(yǎng)瓶中，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞傳代

細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)去培養(yǎng)基，10ml PBS清洗1-2次。加入0.7-1ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，用力拍打瓶壁，間隔 5-10s放到顯微鏡下觀察，50-70%的細(xì)胞脫落后，加入 2ml 以上wan全培養(yǎng)基中止消化；然后分瓶，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

02. 細(xì)胞凍存 

細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，去培養(yǎng)基，10ml PBS清洗2次加入0.7-1ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，用力拍打瓶壁，間隔 5-10s放到顯微鏡下觀察，50-70%的細(xì)胞脫落后，加入 2ml 以上wan全培養(yǎng)基中止消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，1000rpmX5min，棄上清液。加入lml凍存液（90%血清，10%DMSO），放入凍存盒內(nèi)，立即放入一80℃冰箱內(nèi)，過夜，第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放入液氮中，可以保存三個(gè)月。

凍存液的配制：90%血清+10%DMSO ;DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。

03.細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng) 

（1）進(jìn)入細(xì)胞間開始細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，必須嚴(yán)格按照下列步驟操作：

①確定所有的細(xì)胞操作用的溶液和耗材都已經(jīng)消毒并檢測沒有問題，不確定的溶液和耗材請(qǐng)勿使用。

②確定衣服的袖口已經(jīng)卷起或者白大褂的袖口已經(jīng)扎緊。

③確定酒精燈內(nèi)的酒精量，需要的話及時(shí)進(jìn)行補(bǔ)充。

④確定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開啟瓶蓋，實(shí)驗(yàn)開始前可以把所有瓶蓋旋松。

⑤盡量不要直接傾倒溶液，除非瓶口沒有被燒壞。如果傾倒失敗，溶液粘在瓶口，請(qǐng)用噴過75%酒精的紙巾仔細(xì)清潔瓶口周圍（不要接觸到瓶口）后在火焰上簡單燒灼。

⑥操作時(shí)如果不能肯定所用的耗材是潔凈的，必須及時(shí)更換。

⑦實(shí)驗(yàn)完畢及時(shí)收拾，保持工作區(qū)域清潔整齊，最后用75%酒精清潔臺(tái)面。

（2）細(xì)胞污染的預(yù)防

①實(shí)驗(yàn)用品防止污染。細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑、耗材、器材的清洗、消毒要chedi，各種溶液滅菌要仔細(xì)，并在無菌實(shí)驗(yàn)檢測陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔、消毒、滅菌。

②操作過程防止污染。

③穿著容易起靜電或吸附灰塵的衣物必須更換為白大褂后才能進(jìn)入細(xì)胞間。

④實(shí)驗(yàn)開始前需要確定戴的手套沒有問題，只要接觸過生物安全柜之外的物品，必須及時(shí)對(duì)手套進(jìn)行消毒。

⑤進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)間后關(guān)好門，坐下來盡量少走動(dòng)以免影響生物安全柜的風(fēng)簾。工作開始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶蓋。事先要嚴(yán)格檢查所用的器材、溶液和細(xì)胞，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內(nèi)，更不能隨便使用，以免造成大規(guī)模污染。

⑥細(xì)胞操作時(shí)動(dòng)作要輕，必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口，并將瓶口放在火焰周圍簡單轉(zhuǎn)動(dòng)燒灼，注意不要讓火焰把塑料瓶口燒化。

⑦實(shí)驗(yàn)操作時(shí)生物安全柜的隔板要盡可能放低，盡量減少談話，打噴嚏或咳嗽時(shí)絕對(duì)不能對(duì)著工作區(qū)，以免造成不必要的污染。

⑧瓶蓋應(yīng)當(dāng)?shù)狗旁谶h(yuǎn)離自己的地方，以避免瓶蓋被誤操作所污染。

⑨不要從敞開的容器口上方經(jīng)過，以避免衣服上掉落不明物體對(duì)細(xì)胞的污染。

⑩實(shí)驗(yàn)操作時(shí)要注意及時(shí)更換巴斯德吸管、移液槍槍頭和移液管，切勿一根管子做到底。一旦發(fā)現(xiàn)接觸了非潔凈或者無法確定潔凈的物品必須直接丟棄。實(shí)驗(yàn)完畢應(yīng)及時(shí)收拾，保持實(shí)驗(yàn)室清潔整齊，最后用75%酒精清潔臺(tái)面。

（3）防止細(xì)胞交叉污染

①在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分，最好作上標(biāo)記便于辨別。按順序進(jìn)行操作，一次只處理一種細(xì)胞，多種細(xì)胞多種操作一起進(jìn)行時(shí)易發(fā)生混亂。

②在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí)，粘有細(xì)胞的移液槍頭和移液管不要觸及試劑瓶瓶口，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)基中污染其他細(xì)胞。

③所有細(xì)胞一旦購置，或從別處引入，或自己建立，必須及時(shí)保種凍存，一旦發(fā)生污染可重新復(fù)蘇細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。