今年我們非常榮幸請(qǐng)到圣裘德兒童研究醫(yī)院Dr.Jessica Wagner和?？怂拐彩堪┌Y中心的 Dr.Harvey Hensley為大家分享:使用分子影像技術(shù)在體內(nèi)和體外水平揭示小分子藥物 ONC201的抗腫瘤活性和免疫刺激作用。以下是報(bào)告的精彩內(nèi)容：

ONC201背景介紹

在2013年以前，美國(guó)濱州州立大學(xué)(PennState University)和濱州赫爾歇醫(yī)療中心(Penn State Hershey MedicalCenter)的研究人員，通過(guò)篩選 NCI的免費(fèi)分子庫(kù)得到是一種高效的 抗癌分子，即ONC201 (又稱TIC10或NSC350625)。

在2013年，Allen實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的文章中顯示，TIC10,也就是ONC201可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞 TRALL（重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體）的水平，對(duì)激酶AKT和MEK實(shí)施雙重 抑制，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a去磷酸化，去磷酸化的FOXO3a發(fā)生從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核的 易位作用，在核內(nèi)結(jié)合編碼基因TRAIL的啟動(dòng)子上調(diào)其轉(zhuǎn)錄。同時(shí)在活體實(shí)驗(yàn)中顯示出 單次劑量的有效性、令人欣喜的安全性和藥代動(dòng)力學(xué)。

Joshua E. Allen et al. Sci Transl Med 5, 171ra17 (2013);

在多個(gè)細(xì)胞系模型和包括結(jié)腸癌、乳腺癌和腦瘤等異種移植實(shí)體瘤模型中，發(fā)現(xiàn)ONC201 通過(guò)誘導(dǎo)TRAIL介導(dǎo)而引發(fā)的細(xì)胞凋亡促進(jìn)腫瘤消退。此外，ONC201還表現(xiàn)出了較好的 藥物特性，如穩(wěn)定性好，口服生物利用度高和良好的血-腦屏障通透性。目前ONC201正 在各種惡性腫瘤中進(jìn)行早期臨床試驗(yàn)測(cè)試。

在2016年kline實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的論文中，證實(shí)ONC201上調(diào)死亡受體DR5和ISR（整合應(yīng)激 反應(yīng)）進(jìn)行腫瘤的殺傷。同時(shí)，ONC201通過(guò)雙重阻礙Akt和ERK,從而釋放Foxo3a進(jìn)入 核并且激活TRAIL基因的轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)內(nèi)源性TRAIL表達(dá)Dr.Jessica Wagner 實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn) ONC201通過(guò)類似于細(xì)胞效應(yīng)引發(fā)的壓力信號(hào)誘導(dǎo)eIF2-a-依 賴的活性轉(zhuǎn)錄因子ATF4和CHOP，增加DR5的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

研究正文

Dr.Jessica Wagner 在 2018年發(fā)表在 JCI雜志上的文章中，主要證實(shí)了以下三個(gè)結(jié)論。

1. 增加ONC201劑量和頻率，療效會(huì)隨之增強(qiáng)（引導(dǎo)正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)更改ONC201的 劑量）;

2. ONC201 在活體水平可以抑制原位和轉(zhuǎn)移的腫瘤，在體外水平也證實(shí)了可以抑制浸潤(rùn)和 遷移；

3. ONC201誘導(dǎo)NK細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞中的累積和激活。

模型選擇

為了證實(shí)以上結(jié)論，Dr.Jessica Wagner采用了幾種動(dòng)物模型，小鼠皮下腫瘤模型、原位接 種模型及腫瘤轉(zhuǎn)移模型。在轉(zhuǎn)移模型中發(fā)現(xiàn)，Vehicle 組的小鼠在肺部出現(xiàn)四個(gè)轉(zhuǎn)移位點(diǎn)， 在ONC201治療組并未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移位點(diǎn)。

小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型

1. 皮下/原位接種腫瘤細(xì)胞形成原位腫瘤： 小鼠形成微小的轉(zhuǎn)移位點(diǎn)

2. 手術(shù)去除原位腫瘤 ：原位腫瘤直徑大小在6-10mm時(shí)進(jìn)行去除； 2-5 個(gè)月形成轉(zhuǎn)移位點(diǎn)，時(shí)間取決于細(xì)胞系。

3. 尾靜脈注射方式 ：最后一個(gè)模型是相對(duì)比較快速的，需要2-3周。尾靜脈注射的方法也是經(jīng)典的 方法，注射之后細(xì)胞會(huì)在肺部積累。雖然這個(gè)方法比較快速，但是不是優(yōu)選的 模型。一般是在原位腫瘤未發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)的時(shí)候，才將腫瘤細(xì)胞接種在血液中。

檢測(cè)方法

在這篇文章中，大量采用Revvity公司的影像系統(tǒng)來(lái)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，使用小 動(dòng)物活體成像平臺(tái)及多光譜成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)生物發(fā)光信號(hào)和 GFP 的熒光信號(hào)。使用 IVIS系統(tǒng)進(jìn)行生物發(fā)光成像，可以非常容易監(jiān)測(cè)皮下和原位腫瘤的生長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 增加ONC201 劑量能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

ONC201 對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用具有劑量依賴性。加入每3周一次的注射 頻率在臨床是耐受的，臨床前實(shí)驗(yàn)提示證實(shí)，通過(guò)劑量增強(qiáng)可以增加ONC201的抗 腫瘤效果。文章發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌HCT116 p53–/–, HT29, 和乳腺癌MDA-MB-231模型 中，增加ONC201劑量，治療增強(qiáng)。

同樣Dr.Jessica Wagner2018年發(fā)表在JECCR的文章中，使用熒光成像觀察HCT116 –GFP腫瘤，并 使用探針superhance 680 觀察腫瘤血管影像，從腫瘤的影像可以看出，Vehicle處理組腫瘤內(nèi)部具有 豐富的血流，ONC201處理組并沒(méi)有大量的減少血管的量，而血管靶向藥物Bevacizumab明顯的減少 腫瘤血管的數(shù)量。這些結(jié)果提示我們可以將ONC201和抗血管類的藥物聯(lián)合使用進(jìn)行腫瘤治療。

生物發(fā)光檢測(cè)轉(zhuǎn)移位點(diǎn)

使用IVIS系統(tǒng)對(duì)解剖后肝臟及肺部的轉(zhuǎn)移位點(diǎn)進(jìn)行生物發(fā)光的成像，MDA-MB-231轉(zhuǎn)移模 型中，可以看出ONC201治療組的腫瘤明顯小于對(duì)照組，并且發(fā)生率也低于對(duì)照組，甚至 25mg/kg4周注射一次，都能達(dá)到治療效果。

熒光成像檢測(cè)轉(zhuǎn)移位點(diǎn)

手術(shù)去除原位腫瘤（HCT116GFP）,在轉(zhuǎn)移性形成時(shí)給予治療vehicle 或100 mg/kg ONC201，測(cè)量最后轉(zhuǎn)移腫瘤的數(shù)量和大小。從圖中可以看出轉(zhuǎn)移位點(diǎn)出現(xiàn)在結(jié)腸和肝臟 的位置。ONC201治療組可以明顯減少腫瘤的轉(zhuǎn)移。

Micro CT成像技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)移位點(diǎn)

進(jìn)一步使用Revvity公司Quantum Micro CT系統(tǒng)檢測(cè)ONC201在小鼠轉(zhuǎn)移模型中的抗轉(zhuǎn)移的 效果。使用HT29尾靜脈注射模型，經(jīng)過(guò)ONC201或Vehicle治療后，可以看到ONC201 可以 減小肺部轉(zhuǎn)移位點(diǎn)的體積，而Vehicle處理組腫瘤在持續(xù)生長(zhǎng)。

組織定量病理成像

使用Vectra全自動(dòng)定量病理系統(tǒng)結(jié)合Inform軟件對(duì)IHC組織進(jìn)行成像和分析，檢測(cè)微弱表達(dá) 的生物標(biāo)志物。Inform軟件具有自學(xué)習(xí)功能，通過(guò)訓(xùn)練可以快速的區(qū)分腫瘤實(shí)質(zhì)、間質(zhì)及 其他區(qū)域，并且進(jìn)行定量。我們選用MDA-MB-231細(xì)胞系及MDA-MB-231shTRAIL細(xì)胞， 接種在小鼠體內(nèi)。Vehicle 或ONC201治療四周后，每個(gè)腫瘤組織取兩張切片使用Vectra系 統(tǒng)進(jìn)行掃描，整張切片使用Inform進(jìn)行分析。有趣的是，在野生型腫瘤模型中，Vehicle 或 ONC201治療組cleaved caspase-3表達(dá)有輕微的區(qū)別，而Ki-67+ 細(xì)胞的數(shù)量相差很大。 shTRAIL tumors模型中并沒(méi)有明顯的變化。這些結(jié)果說(shuō)明ONC201對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用 至少部分是TRAIL-依賴途徑下調(diào)腫瘤細(xì)胞的遷移和入侵的方法實(shí)現(xiàn)的。

參考文獻(xiàn)：

1. Jessica Wagner et al., Dose intensification of TRAIL-inducing ONC201 inhibits metastasis and promotes intratumoral NK cell recruitment J Clin Invest. 2018;128(6):2325-2338.

2. Jessica Wagner et al. Anti-tumor effects of ONC201 in combination with VEGF-inhibitors significantly impacts colorectal cancer growth and survival in vivo through complementary non overlapping mechanisms Journal of Experimental & Clinical Cancer Research (2018) 37:11.

3. Allen JE, et al. Dual inactivation of Akt and ERK by TIC10 signals Foxo3a nuclear translocation,TRAIL gene induction, and potent antitumor effects. Sci Transl Med. 2013;5(171):171ra17.