Piezo1-mediated M2 macrophage mechanotransduction enhances bone formation through secretion and activation of transforming growth factor-β1

KWS：Piezo1；M2 macrophage；mechanotransduction；bone formation；TGF-β1

骨骼是一種動態(tài)組織，通過兩個(gè)密切聯(lián)系的過程維持生長和重塑：骨吸收（bone resorption）和骨形成（bone formation）。免疫細(xì)胞在骨重塑過程中處于壓力和負(fù)荷之下，它們在免疫中的作用尚未得到充分分析。巨噬細(xì)胞是多用途的免疫系統(tǒng)細(xì)胞，對代謝控制、病原體防御和組織修復(fù)至關(guān)重要。M1巨噬細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素6（IL-6）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS），M2巨噬細(xì)胞產(chǎn)生精氨酸酶-1（Arg-1）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、重組甘露糖受體C型（MRC1）、CD206和TGF-β，對骨重塑過程至關(guān)重要。

Piezo1，一種非選擇性 Ca2+ 滲透性陽離子通道，已被證明可以將機(jī)械信號傳遞到巨噬細(xì)胞，從而可以檢測機(jī)械應(yīng)力。研究表明，Piezo1在骨組織中被下調(diào)，從而減緩骨折愈合，而其特異性激動劑激活Piezo1可加速骨折愈合和軟骨轉(zhuǎn)化為骨骼。此外，張力可以影響巨噬細(xì)胞功能和向M2的極化，并證明了10% 的應(yīng)變強(qiáng)度是激活M2型巨噬細(xì)胞的zuijiaxuanzhe。最近的研究表明，巨噬細(xì)胞通過促進(jìn)血管生成和成骨，至少部分通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）在骨形成中起著至關(guān)重要的作用。體內(nèi)研究也表明，TGF-β1 對骨修復(fù)至關(guān)重要。然而，巨噬細(xì)胞介導(dǎo)骨骼發(fā)育的機(jī)制仍然知之甚少。

盡管大量研究表明巨噬細(xì)胞對間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的成骨作用，但在機(jī)械張力下，哪種巨噬細(xì)胞表型對MSC有利尚無定論。在南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔正畸科、蘇州大學(xué)附屬獨(dú)墅湖醫(yī)院口腔科及江蘇省口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究中，創(chuàng)建了一個(gè)張力細(xì)胞模型來研究機(jī)械應(yīng)變?nèi)绾斡绊懢奘杉?xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)最佳機(jī)械應(yīng)變幅度表現(xiàn)出強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用并促進(jìn) M2 巨噬細(xì)胞極化。該研究證明了 Piezo1 介導(dǎo)的鈣內(nèi)流變化以及 p53 乙?；腿ヒ阴；?，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞向 M2 極化，分泌 TGF-β1 并促進(jìn) BMSC 成骨。研究成果發(fā)表在 Cell Proliferation 期刊題為“Piezo1-mediated M2 macrophage mechanotransduction enhances bone formation through secretion and activation of transforming growth factor-β1”。

首先，鑒于M2巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)MSCs成骨分化，因此，研究人員假設(shè)機(jī)械張力會刺激 M2 型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致 BMSCs 啟動成骨。實(shí)驗(yàn)將RAW264.7細(xì)胞暴露于10%，0.5 Hz的循環(huán)正弦連續(xù)拉伸應(yīng)變0-6小時(shí)以檢查巨噬細(xì)胞的變化（圖1 A），發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長，巨噬細(xì)胞上出現(xiàn)了更多的偽足，表明存在更多的M2型巨噬細(xì)胞，且M2巨噬細(xì)胞釋放主要細(xì)胞因子的表達(dá)水平也升高。

為了研究巨噬細(xì)胞對張力的極化響應(yīng)，對M1-和M2-極化巨噬細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，發(fā)現(xiàn)應(yīng)變增加了 RAW264.7 細(xì)胞中 CD206+ 細(xì)胞的比例，進(jìn)一步表明應(yīng)變改變了巨噬細(xì)胞的表型。此外，對 F4/80 和 CD206（M2 標(biāo)志物）進(jìn)行了雙重免疫染色，發(fā)現(xiàn)M2巨噬細(xì)胞的增加在第2h更為明顯，RAW264.7細(xì)胞強(qiáng)烈表達(dá)F4/80。這些結(jié)果表明，張力以時(shí)間依賴性方式導(dǎo)致巨噬細(xì)胞極化為M2型，并且在2h時(shí)影響變得更加明顯。因此，2h便作為進(jìn)一步研究的時(shí)間點(diǎn)。

為了檢測巨噬細(xì)胞衍生培養(yǎng)基是否對BMSCs的遷移有影響，將BMSCs和巨噬細(xì)胞間接共培養(yǎng)（圖1 A）。結(jié)果顯示，2h張力刺激時(shí)遷移潛力最大（圖1 B）。此外，與 RAW264.7 細(xì)胞間接共培養(yǎng)的 BMSCs 增殖也受到影響，不同張力處理組（0、1h、2h、4h 、6h）的 BMSCs 均表現(xiàn)出更高的增殖潛力，且在 2h時(shí)出現(xiàn)峰值（圖1 C、D）。通過劃痕愈合試驗(yàn)檢測BMSCs的橫向遷移能力，發(fā)現(xiàn)接受條件培養(yǎng)基的細(xì)胞在第2h內(nèi)顯示更大的橫向遷移能力（圖1 E）。這說明，來自張力刺激的 RAW 264.7 細(xì)胞的條件培養(yǎng)基顯著促進(jìn)了 BMSCs 的增殖和遷移，表明它可能通過增強(qiáng)干細(xì)胞歸巢對組織愈合產(chǎn)生積極影響。

圖1     張力下的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基促進(jìn)了 BMSCs 的增殖和遷移。

接下來，為了研究巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)對成骨分化的影響，在不同暴露時(shí)間的張力下在各自的條件培養(yǎng)基中刺激BMSCs向成骨細(xì)胞分化。值得注意的是，2h張力組BMSCs的成骨潛力顯著增加，成骨相關(guān)標(biāo)記物（COL1、RUNX2和OPN）的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著上調(diào)。這說明，在免疫環(huán)境中，2h的拉伸應(yīng)變可能通過控制 M2 巨噬細(xì)胞極化來促進(jìn)成骨。

為了確定為什么施加應(yīng)力會影響巨噬細(xì)胞極化，實(shí)驗(yàn)檢測了鈣離子信號，發(fā)現(xiàn)與其他通道相比，Piezo1的表達(dá)非常高。因此，研究人員假設(shè)張力誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化與Piezo1介導(dǎo)的鈣內(nèi)流密切相關(guān)。根據(jù)RT-PCR和細(xì)胞免疫熒光結(jié)果，Piezo1在應(yīng)變2h后顯著升高。通過敲低 Piezo1，發(fā)現(xiàn)了 p53 信號通路，與對照組和其他時(shí)間段相比，張力刺激1h后乙?；?/span>p53的熒光強(qiáng)度非常高。

然而，p53的乙酰化以及巨噬細(xì)胞極化是否可能受到機(jī)械應(yīng)力的影響還不確定，因此敲低Piezo1以研究其是否對p53及其乙?；杏绊?，發(fā)現(xiàn)敲低Piezo1增加了乙?；?/span>p53的表達(dá)。由于乙酰化 p53 與 iNOS 的變化一致，實(shí)驗(yàn)又探討了Piezo1 缺失是否會改變巨噬細(xì)胞極化，發(fā)現(xiàn)敲低Piezo1后張力刺激下RAW264.7細(xì)胞中促炎基因和M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物顯著下調(diào)。通過建立對照組、Piezo1敲低組和Yoda1激活Piezo1組，發(fā)現(xiàn)Piezo1激活組的巨噬細(xì)胞幾乎全部為M2型，Piezo1敲低組的iNOS表達(dá)量幾乎是對照組的一半。這些數(shù)據(jù)表明，Piezo1 對于巨噬細(xì)胞極化為 M2 表型至關(guān)重要。

有趣的是，Piezo1 敲低導(dǎo)致鈣內(nèi)流減少，在向培養(yǎng)基中加入 1 μL/mL Yoda1 和 2h機(jī)械張力刺激后，巨噬細(xì)胞中鈣內(nèi)流顯著增加（圖2 A）。此外，BMSCs的遷移和增殖與鈣內(nèi)流的趨勢相一致，應(yīng)變2h后Yoda1 的給藥對 BMSCs 遷移的影響最大。Piezo1敲低后，巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基對BMSCs幾乎沒有影響（圖2 B、C）。進(jìn)一步檢測BMSCs的成骨分化能力，發(fā)現(xiàn)在相同條件下，Piezo1過表達(dá)后，巨噬細(xì)胞的上清液大大增加了BMSCs的成骨能力。相反，在巨噬細(xì)胞張力暴露2h后，敲低Piezo1對條件培養(yǎng)基中的BMSCs幾乎沒有影響（圖2 D-F）。總體而言，Piezo1對機(jī)械力的傳遞至關(guān)重要，甚至可以調(diào)節(jié)機(jī)械張力是否會影響巨噬細(xì)胞極化，從而影響BMSC的遷移、增殖和成骨分化。

圖2    Piezo1敲低抑制BMSCs的增殖、遷移和成骨分化。

巨噬細(xì)胞極化后產(chǎn)生TGF-β1等對BMSC成骨有影響的細(xì)胞因子，因此評估了巨噬細(xì)胞分泌的TGF-β1在張力下的mRNA和蛋白水平。結(jié)果表明，機(jī)械張力可以刺激TGF-β1的分泌，特別是在2 h。在向間接共培養(yǎng)系統(tǒng)加入不同劑量的TGF-β1抗體12-48h后，不同處理組的BMSCs增殖潛力均顯著降低，遷移能力也顯示相似的趨勢。此外，TGF-β1抗體處理顯著降低了BMSCs的成骨表達(dá)。這表明，機(jī)械張力導(dǎo)致巨噬細(xì)胞向M2極化并釋放TGF-β1，進(jìn)而促進(jìn)BMSCs的遷移、增殖和成骨分化。

最后，研究人員建立了一個(gè)小鼠運(yùn)動模型來研究 Piezo1 和 TGF-β1 在骨再生過程中的作用，分為久坐小鼠（對照組）和運(yùn)動小鼠，并注射水、Piezo1 抑制劑（GsMTx-4）或 TGF-β 受體 I、II 抑制劑（LY-364947）。結(jié)果顯示，跑步顯著增加了小鼠的骨量，但當(dāng)Piezo1被抑制時(shí)，機(jī)械力傳遞也停止了，且GsMTx-4注射組的骨量與對照組幾乎相同。巨噬細(xì)胞釋放的TGF-β1在TGF-β受體I、II被阻斷后未能發(fā)揮作用，導(dǎo)致小鼠脛骨骨修復(fù)受損（圖3 A）。HE染色結(jié)果顯示，跑步組骨小梁數(shù)量顯著增加，然而，對照組和接受藥物注射組的骨小梁明顯減少（圖3 B）。免疫熒光染色顯示，跑步可顯著提高F4/80+ 陽性巨噬細(xì)胞的TGF-β1分泌，但Piezo1抑制劑顯著阻礙了這種作用（圖3 C）。因此，抑制Piezo1大大降低了巨噬細(xì)胞分泌的TGF-β1，從而減少了運(yùn)動引起的體內(nèi)骨量增加。

圖3    TGF-β1和Piezo1的敲低均可降低跑步小鼠的骨重塑。

  圖4    圖形概要。Piezo1介導(dǎo)的機(jī)械張力刺激巨噬細(xì)胞極化和TGF-β1的分泌，促進(jìn)成骨分化。p53的乙酰化和去乙?；谶@個(gè)過程中起著重要作用。

總之，該研究發(fā)現(xiàn)機(jī)械力通過Piezo1介導(dǎo)鈣內(nèi)流、p53乙?；腿ヒ阴；淖兓?，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2極化，分泌TGF-β1并促進(jìn)BMSCs成骨。這表明 Piezo1 介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞機(jī)械信號傳導(dǎo)是骨骼免疫學(xué)的基礎(chǔ)，為今后臨床治療骨外傷、骨質(zhì)疏松和頜骨牽引提供線索。

參考文獻(xiàn)：Cai G, Lu Y, Zhong W, Wang T, Li Y, Ruan X, Chen H, Sun L, Guan Z, Li G, Zhang H, Sun W, Chen M, Zhang WB, Wang H. Piezo1-mediated M2 macrophage mechanotransduction enhances bone formation through secretion and activation of transforming growth factor-β1. Cell Prolif. 2023 Sep;56(9):e13440. doi: 10.1111/cpr.13440. Epub 2023 Mar 7. PMID: 36880296; PMCID: PMC10472522.

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