基因功能研究一直是科學(xué)研究的核心內(nèi)容，科學(xué)家們往往先發(fā)現(xiàn)表型，再去研究機(jī)制，那么如何從表型出發(fā)發(fā)現(xiàn)相關(guān)的基因呢？高通量基因篩選應(yīng)運(yùn)而生。在基因篩選實(shí)驗(yàn)中，RNA干擾（RNAi）仍然是有效的篩選方法。通過合成小干擾 RNA（siRNA）進(jìn)行RNA干擾更是基因篩選研究的。

今天小編帶大家快速學(xué)習(xí)一篇Nature paper，看看siRNA基因沉默篩選如何開展，及最終如何發(fā)現(xiàn)病毒自噬新機(jī)制。

背景

細(xì)胞使用自噬來降價(jià)不需要的物質(zhì)。自噬過程首先將不需要的物質(zhì)隔離在自噬小體（autophagosome）中，然后自噬小體與溶酶體融合，將里面的物質(zhì)降解為構(gòu)成單元（building block），比如氨基酸，并將它們回收用于其他用途。

自噬物質(zhì)包括舊的或有缺陷的細(xì)胞器和蛋白、細(xì)菌和病毒入侵者。科學(xué)家們已經(jīng)基本確定了細(xì)胞啟動(dòng)和調(diào)節(jié)自噬的途徑。然而，迄今為止還不清楚，是否有一條途徑專門針對(duì)病毒進(jìn)行自噬。

研究過程

1.

為了尋找針對(duì)病毒的自噬途徑，首先開展了全基因組siRNA基因沉默篩選：

初篩基于自噬小體的點(diǎn)狀表型（GFP-LC3標(biāo)記）：使用兩種病毒SIN或HSV-1ΔBBD感染 HeLa/GFP-LC3細(xì)胞后，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生GFP-LC3自噬小體點(diǎn)。作者分別用這兩個(gè)感染體系來進(jìn)行篩選，使用了Dharmacon siGENOME siRNA全基因組文庫(kù)，通過成像檢測(cè)LC3點(diǎn)的數(shù)量，選擇那些沉默后導(dǎo)致病毒誘導(dǎo)自噬小體點(diǎn)減少的基因，且排除了那些有明顯細(xì)胞毒性（細(xì)胞生長(zhǎng)異常）或者影響生理性自噬的基因，初篩共獲得了310個(gè)潛在陽(yáng)性基因；

驗(yàn)證性篩選（去卷積篩選）基本重復(fù)了這一過程，使用了Dharmacon Cherry-pick siGENOME library siRNA set of 4，僅有>=2條siRNA能重復(fù)出表型的基因被篩選出來，共篩選出來216個(gè)陽(yáng)性基因，其中兩種病毒感染體系的交集有154個(gè)基因；

展開生物信息學(xué)分析，確定了分子功能相關(guān)的陽(yáng)性基因集，再考慮到大多數(shù)病毒通過細(xì)胞內(nèi)吞作用侵入細(xì)胞，最終選定SNX5（sorting nexin 5）作為進(jìn)一步研究的對(duì)象。SNX5是一種細(xì)胞內(nèi)吞體蛋白，包含兩段重要的結(jié)構(gòu)域：一段可與磷酸肌醇（如 PtdIns(3)P）結(jié)合的PX結(jié)構(gòu)域；一段感知、驅(qū)動(dòng)膜結(jié)構(gòu)彎曲的BAR結(jié)構(gòu)域。

2.

在其他病毒中進(jìn)一步驗(yàn)證SNX5的效果：

細(xì)胞和小鼠的病毒感染實(shí)驗(yàn)表明，siRNA沉默后SNX5后抑制了寨卡病毒（Zika virus）、西尼羅河病毒（WNV）、基孔肯雅病毒(CHIKV) 八種來自五個(gè)差異巨大的病毒科的人類病毒的感染后自噬；

3.

免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析SNX5的相互作用蛋白：

SNX5與PI3KC3-C1發(fā)生相互作用進(jìn)而激活細(xì)胞自噬，兩者間相互作用無(wú)需PI3KC3-C1脂質(zhì)激酶激活，提示SNX5作用于PtdIns(3)P上游；

4.

細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)分析SNX5蛋白功能：

熒光標(biāo)記病毒侵染細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)SNX5選擇性募集到毒顆粒的內(nèi)吞體表面，而BAR突變型SNX5不會(huì)出現(xiàn)募集。BAR結(jié)構(gòu)域內(nèi)帶正電基團(tuán)可通過靜電作用介導(dǎo)帶BAR結(jié)構(gòu)域的蛋白與雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)相互作用，提示SNX5通過BAR結(jié)構(gòu)域提高膜的曲率來活化自噬相關(guān)的PI3KC3-C1激酶復(fù)合體，從而激活自噬。

5.

驗(yàn)證SNX5自噬通路是否是病毒誘導(dǎo)特異性的：

siRNA沉默囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體基因VPS29并檢測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（GLUT-1）逆向轉(zhuǎn)運(yùn)功能，VPS29敲減后囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體功能發(fā)生障礙但病毒誘導(dǎo)自噬未受影響。另一方面，SNX5KO HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體回收循環(huán)動(dòng)力學(xué)和表皮生長(zhǎng)因子降解效率均未受影響，提示SNX5敲除不影響早期及晚期細(xì)胞內(nèi)吞活動(dòng)。

討論

這些結(jié)果共同表明，細(xì)胞確實(shí)有一條的病毒自噬途徑，該途徑是由SNX5控制的。這一新發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生物學(xué)、病毒學(xué)和自噬學(xué)中一個(gè)重要基礎(chǔ)知識(shí)的空白，并為基于自噬調(diào)控的廣譜抗病毒治療策略和藥物的研發(fā)提供了重要的基礎(chǔ)。

這篇研究全篇使用了Dharmacon的siRNA文庫(kù)，Dharmacon siRNA產(chǎn)品有如下特點(diǎn)：

SMARTselectionTM技術(shù)?高度特異性，確保沉默效率
我們使用SMARTselection™ 技術(shù)設(shè)計(jì)高質(zhì)量siRNA，該技術(shù)涵蓋一整套完整而嚴(yán)密的設(shè)計(jì)算法，針對(duì)每個(gè)基因投放的4條siRNA至最終的產(chǎn)品中。

SMARTpoolTM技術(shù)?無(wú)需驗(yàn)證，保證至少75％靶基因沉默效率
我們通過SMARTpoolTM技術(shù)更好的模擬內(nèi)源RNAi通路，將針對(duì)同一靶基因的4條siRNA混合成為一管試劑，保證更高效的基因沉默效率。同時(shí)，由于每條siRNA的濃度相對(duì)降低而減少了脫靶效應(yīng)（off-target），增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)性。

雙鏈修飾技術(shù)，有效減少off-target并進(jìn)一步提升沉默效率
siRNA是雙鏈結(jié)構(gòu)，最主要的脫靶效應(yīng)是由反義鏈中“seed region”活性引起的，此外，正義鏈也有可能引起脫靶。我們擁有的雙鏈修飾技術(shù)，對(duì)正義鏈和反義鏈同時(shí)進(jìn)行修飾，能夠有效的減少脫靶效應(yīng)90%以上，同時(shí)抑制miRNA-like作用，并能有效減少細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制，保證沉默效率的同時(shí)防止假陽(yáng)性。

文獻(xiàn)好物推薦