科德角國際的合作企業(yè)美國ACC公司（Associates Of Cape Cod）自2021年起，推出了PyroSmart NextGen®重組級聯(lián)試劑(rCR)，標(biāo)志著細(xì)菌內(nèi)毒素檢測（BET）領(lǐng)域的一次重大革新。

為了響應(yīng)《美國藥典-國家處方集》（USP-NF）收錄第<86>章“使用重組試劑的細(xì)菌內(nèi)毒素測試”，研究團(tuán)隊使用PyroSmart NextGen®重組鱟試劑（PSNG）對替代細(xì)菌內(nèi)毒素測試方法進(jìn)行了一系列的驗證。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢測（BET）是一項關(guān)鍵的質(zhì)量控制流程，利用從鱟血液中提取的鱟變形細(xì)胞裂解物（LAL）試劑，有效檢測和量化腸外藥品及醫(yī)療器械中的革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素。

PyroSmart NextGen®重組鱟試劑(PSNG)是市場上第一款完整的重組級聯(lián)試劑(rCR)，包含重組C因子、重組B因子、重組凝固酶原。該試劑的核心優(yōu)勢在于其消除了LAL試劑批次間的差異性，并避免了因（1→3）-β-D-葡聚糖凝結(jié)途徑誤觸發(fā)的假陽性問題。此外，采用重組鱟試劑還符合動物福利保護(hù)的原則，推動了細(xì)菌內(nèi)毒素檢測技術(shù)的可持續(xù)發(fā)展。

在美國，重組試劑被認(rèn)為是藥典LAL試劑的替代品，因此，將這些重組試劑?于細(xì)菌內(nèi)毒素檢測需要進(jìn)?驗證，以證明結(jié)果等于或優(yōu)于LAL試劑測定的結(jié)果。

本研究通過一系列分析性能評估，包括線性、準(zhǔn)確度、精密度、檢測范圍、定量限及特異性等，依據(jù)USP<1225>和ICH Q2指南，對PyroSmart NextGen®（重組鱟試劑）、Pyrochrome®（顯色法鱟試劑）及Pyrotell®-T（濁度法鱟試劑）根據(jù)內(nèi)部驗收標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了全面比較，證實了其等效性。

此外，還使用PyroSmart NextGen® 和兩種LAL試劑對三個批次的腸外藥物樣品進(jìn)行了測試，以便根據(jù)USP<1085> 和USP<85> 直接比較方法適用性結(jié)果。這一過程嚴(yán)格遵循了USP<1085>和USP<85>的標(biāo)準(zhǔn)，旨在通過實際樣品測試來驗證并對比各方法在檢測細(xì)菌內(nèi)毒素方面的適用性結(jié)果。

一、方法和結(jié)果

1、PyroSmart NextGen® 的分析性能（非產(chǎn)品特定方法驗證測試）

使?PyroSmart NextGen®定量的所有標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度和三個單獨制備的USP-RSE（美國藥典參考標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素）濃度均滿?線性、準(zhǔn)確度、精密度、范圍和定量限規(guī)范（表1和表2）。因此，PyroSmart NextGen®的分析性能符合 USP<1225>和ICH Q2準(zhǔn)則的規(guī)定。

2、PyroSmart NextGen® 的方法適用性（產(chǎn)品特定測試）

使?三種PPC（陽性產(chǎn)物對照）濃度測試的三批注射用檸檬酸鈉滿足線性、準(zhǔn)確度、精密度、范圍、定量限、特異性和穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)（表3和表4）。根據(jù) USP<1085> 、USP<85> 、USP<1225> 和ICH Q2指南（雜質(zhì)定量測試），PyroSmart NextGen®的產(chǎn)品特定?法適?性已得到證明。

3、PyroSmart NextGen®和LAL試劑的等效性測試

Pyrochrome®和Pyrotell®-T產(chǎn)生的結(jié)果均符合分析性能和方法適用性的內(nèi)部驗收標(biāo)準(zhǔn)。將LAL試劑與PyroSmart NextGen®直接比較表明，PyroSmart NextGen®在所有參數(shù)上均具有相同或更好的結(jié)果（表 1-表4）。

4、PyroSmart NextGen®的精密度

額外的精確度分析表明，PyroSmart NextGen®的最大變異系數(shù)為20.89%，而Pyrochrome®的最大變異系數(shù)為23.22%，Pyrotell®-T的最大變異系數(shù)為29.24%（圖1）。這表明PyroSmart NextGen®在重復(fù)性測試中具有更高的穩(wěn)定性和可靠性。

所有含有可檢測（在本例中為添加）內(nèi)毒素的樣品（三個單獨制備的USP-RSE濃度和注射用檸檬酸鈉樣品PPC）的相對回收率結(jié)果均在50-200%范圍內(nèi)（圖2）。

二、結(jié)論

PyroSmart NextGen®展現(xiàn)出卓-越的性能，能夠有效從各類干擾藥物中回收內(nèi)毒素，其回收率與傳統(tǒng)的LAL試劑相當(dāng)。在針對如注射用檸檬酸鈉等多種產(chǎn)品的測試中，PyroSmart NextGen®在產(chǎn)品特定的方法適用性數(shù)據(jù)中符合準(zhǔn)確性和精密度要求。

依據(jù)USP<1225>及ICH Q2雜質(zhì)定量檢測指南，研究團(tuán)隊對PyroSmart NextGen®進(jìn)行了包括線性、范圍、定量限、特異性和穩(wěn)定性在內(nèi)的全面分析評估，所有結(jié)果均符合標(biāo)準(zhǔn)，PyroSmart NextGen®具備全面的分析能力。

作為一種先進(jìn)的重組級聯(lián)試劑（rCR），PyroSmart NextGen®完-全符合所有內(nèi)部驗收標(biāo)準(zhǔn)，且在測試多種類型樣品時，其表現(xiàn)等同于或優(yōu)于天然來源的LAL試劑，為細(xì)菌內(nèi)毒素檢測領(lǐng)域提供了一種強(qiáng)有力的替代方案。

原文來源：

Madeline Kelley,Ingrid Stevens,etc.Report: A Demonstration of the Validation Process for Alternative Endotoxin Testing Methods Using PyroSmart NextGen® Recombinant Cascade Reagent.

American Pharmaceutical Review | Endotoxin Supplement 2023-ALTERNATIVE ENDOTOXIN TESTING.Page16-24.