一個優(yōu)xiu的光機械裝置使得研究人員能夠使用膜片鉗、鈣成像和光遺傳學來闡明各種神經遞質的作用，并將它們與人類已知的遺傳缺陷疾bing相關聯(lián)。

要全面理解中shu神jing系統(tǒng)如何與肌肉功能進行溝通和控制，需要揭示神經遞質的精que作用——這些化學信號物質使得一個細胞能夠在沒有直接電連接的情況下影響另一個細胞的活動。但是，盡管現(xiàn)在已經識別出超過200種不同的神經遞質，我們對神經遞質的理解仍然是不完整的。

由俄勒岡健康與科學大學（OHSU，位于波特蘭，OR）的Vollum研究所的Paul Brehm領dao的一個團隊正在使用各種顯微鏡技術，通過研究斑馬魚胚胎中的神經肌肉信號傳導來改變這一現(xiàn)狀。研究人員將電生理測量與差分干涉對比（DIC）和熒光成像結合起來，有時還會使用光遺傳學，在一個依賴于無漂移精que探針運動的顯微鏡裝置中進行工作。通過使用斑馬魚突變體，他們已經將某些遞質缺陷與幾種已識別的人類疾病相關聯(lián)。

用于斑馬魚的顯微鏡技術

斑馬魚胚胎是具有成熟脊椎動物突觸功能和形態(tài)特征的模fan生物，它們的光學透明性使得脊髓神經元和肌肉細胞易于通過視覺識別和直接記錄。“迄今為止，這種微小的生物代表了刺激脊椎動物脊髓中單個神經元并記錄目標肌肉細胞相應活動的wei一機會，”Brehm說（見圖1）。在這些胚胎中，“每個神經元只與特定位置的肌肉進行交流，而每個肌肉細胞只與四個主要脊髓神經元中的一個配對。”

圖1. 透明的斑馬魚胚胎使得可以對脊髓神經元和運動肌肉細胞進行配對的膜片鉗測量。圖中顯示了兩個呈箭頭形重復的尾部肌肉段。為一個單獨的運動神經元和肌肉細胞顯示了兩個膜片鉗記錄電極。因為在形成全細胞記錄模式時電極的放置是在非常高的放大倍數(shù)下進行的，所以視野中只顯示了一個電極。

為了分析神經肌肉功能，該團隊使用了電生理學（膜片鉗技術）進行“全細胞”記錄。細胞通過差分干涉對比（DIC）顯微鏡進行成像和選擇，有時會使用特定于細胞的熒光標記（例如，綠色熒光蛋白，或GFP）和鈣熒光成像。

作為配對記錄工作的一部分，團隊創(chuàng)造并使用了大量的斑馬魚突變體——許多突變體有一個單一的缺陷基因，使它們無法釋放或響應特定的神經遞質。即使是可能導致哺乳動物胚胎死亡的嚴重疾bing，也可以在斑馬魚胚胎中進行研究。

記錄精度控制

在膜片鉗記錄中，一個平頭的微電極管既作為記錄電極也作為刺激電極，并且它以多種方式與細胞（或其部分）相互作用。該團隊的全細胞方法涉及將玻璃尖duan密封到細胞膜上，然后穿透外膜。這導致細胞內部內容物與膜片微電極溶液進行透析，并在放大器與細胞內部之間建立一個共同的電氣連接。關鍵的是，插入過程要在微電極玻璃和膜之間創(chuàng)建一個高阻抗密封，電學上將內容物與周圍的浴液隔離開來。這允許測量細胞內外內容物之間的電位差。整個實驗在一個法拉第籠中進行，以消chu環(huán)境中的電氣噪聲（見圖2）。

圖2. 移測顯微鏡獨立于電生理記錄室和四軸微操縱器安裝。整個裝置被法拉第籠包圍，以屏蔽環(huán)境中的電氣噪聲。

記錄室位于一個新穎的光機械裝置中，該團隊花費了數(shù)年時間來完善。這個裝置是圍繞一臺蔡司正置顯微鏡和Siskiyou微操縱器構建的。顯微鏡配備了一個40X的水浸物鏡和一個長工作距離，以適應兩個或更多的電極。腔體安裝在一個帶有可調節(jié)桿的平臺上，使得樣本可以被固定在某個位置。

研究人員使脊髓暴露，每個半節(jié)段包含一個尾部初級（CaP）運動神經元，他們使用差分干涉對比顯微鏡（見圖1）有時使用GFP來觀察和識別。

從圖3中可以理解與目標神經元形成電封的關鍵機制。帶有2μm直徑尖duan的玻璃微電極安裝在一個四軸（X、Y和Z軸，加上傾斜）微操作器裝置上。團隊在選定MX 7600（Siskiyou）之前嘗試了幾種商業(yè)型號，該型號使用直流伺服執(zhí)行器驅動交叉滾珠軸承臺?！安竭M器和壓電系統(tǒng)存在問題，因為它們傾向于以使精細移動變得困難的增量步進，”Brehm說，并補充說，“液壓系統(tǒng)隨著老化容易漂移，這也是一個問題?！钡?，“直流伺服電機在靜止時不會消耗電流，而且Siskiyou單元不會像其他直流伺服電機那樣表現(xiàn)出常見的反沖/背隙，”他解釋道。他還指出，帶有旋轉旋鈕的控制器（Siskiyou MC1000e-R/T）提供了直接的、高分辨率運動螺桿的響應感，而不是數(shù)字間接接口。

圖3. 全細胞膜片鉗記錄涉及在微電極和目標細胞的細胞質之間建立一個電連接。

30°的接近角度對于清chu目標并允許穿透圍繞脊髓的彈性膜至關重要，特定的軌跡將允許與特定的運動神經元細胞體正確接觸。當研究者將微電極管移向CaP神經元時，他們會保持微小的正壓力以避免碎片在尖duan上積聚。一旦接觸，對尖duan推進的精細控制至關重要。當膜被正確地壓入時，過量正壓的突然移除會導致它反彈并形成所謂的吉加密封（電極內部與外部之間的電阻大于10^9 Ω）。然后將吸管改為負壓，拉動膜并使其破裂。

對于配對記錄，兩個電極位于遠離微小視野范圍的神經元和肌肉上。因此，顯微鏡與固定位置的記錄室和操縱器完quan機械分離。如圖2所示，蔡司移動式顯微鏡安裝在一個由直流伺服執(zhí)行器驅動的運動臺上（Siskiyou MXMS-115cri），以避免在記錄過程中產生電氣噪聲。操縱桿控制器提供真正的對角線運動，與由x、y步進合成的運動不同。兩個微操縱器系統(tǒng)和記錄室直接安裝在支撐整個裝置的光學臺上。

為了設置di二個電極，研究人員使用操縱桿將顯微鏡重新定位到腹側肌肉，并從目標區(qū)域選擇一個快速的肌肉細胞。再次，通過結合壓力和移液管的移動來創(chuàng)建一個密封。研究人員現(xiàn)在有了一種裝置，可以使用游動時的天ran放電模式刺激運動神經元，同時記錄突觸反應（見圖4）。光學熒光檢測器可以提供來自肌肉細胞的突觸傳遞的動態(tài)活動數(shù)據(jù)。

圖4. 來自運動神經元和目標肌細胞的樣本記錄，其中運動神經元以100Hz的頻率受到刺激，并記錄了相應的動作電位。顯示了響應每個運動神經元動作電位的遞質誘導的突觸電流，星號表示刺激的時機。

洞察人類綜合癥

因為這項研究涉及研究神經肌肉傳遞中的基本單元事件，它正在提供適用于高等脊椎動物，特別是人類的神經肌肉功能及其功能障礙的重要見解，其中突變性疾bing統(tǒng)稱為肌無力綜合征。一個例子是rapsyn缺陷型肌無力綜合征，在人類中，其特征是自發(fā)肌肉收縮無力，這是乙酰膽堿受體在運動神經元和肌肉接觸點聚集失敗導致突觸反應大大減少的直接后果。與其他肌無力綜合癥一樣，普遍的肌肉無力伴隨著使用依賴性疲勞，這一點尚未被充分理解。

俄勒岡健康與科學大學（OHSU）的研究團隊通過使用一種稱為配對膜片鉗記錄的技術，研究了斑馬魚（一種常用的模fan生物）的突變品系，這種品系缺乏一個名為rapsyn的蛋白。通過這種方法，他們成功探究了這種疲勞的根本原因。簡而言之，研究者們利用特定的實驗手段，分析了缺乏特定基因的斑馬魚模型，來理解導致疲勞的生物學機制。他們發(fā)現(xiàn)，隨著運動神經元刺激頻率的增加，無論是野生型還是突變型的神經肌肉接頭都會降低到穩(wěn)態(tài)響應水平——但后者顯示出過度的抑制。對穩(wěn)態(tài)傳輸?shù)姆治鼋沂荆诟哳l活動期間，突變魚在單個釋放位點的囊泡重新裝載和釋放顯著減慢。這指向了突觸后受體密度減少和突觸前釋放減慢的組合，這些因素共同作用以降低突觸強度至低于肌肉動作電位產生的閾值，從而解釋了這種重癥肌無力患者使用依賴性疲勞的原因。在單細胞分辨率下詢問神經元間和神經肌肉信號的能力徹di改變了我們對神經科學的理解。這類實驗依賴于能夠以顯微鏡分辨率極xian附近機械操縱探針的能力——無論是緊密聚焦的激光束還是簡單的微吸管。

以下為文中實驗用到的siskiyou產品

MX7600

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MXMS-115cri

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