B-27 無血清添加劑(50X) 是50X 濃度，使用前請用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(如Neurobasal™)稀釋到 1X。如準備50 mL培養(yǎng)基：將1mL的B-27無血清添加劑(50X)加入到49mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)中。

一、培養(yǎng)基的配置

由于 L-谷氨酰胺在水溶液中不穩(wěn)定，其分解產(chǎn)物對細胞具有毒性，神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基和B-27中都未包含 L-谷氨酰胺，因此在配制培養(yǎng)基時須另外添加L-谷氨酰胺。

（1）置于4 ℃解凍本產(chǎn)品。

（2）在使用前無菌添加 2％本產(chǎn)品和0.5 M L-谷氨酰胺至神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配制神經(jīng)元培養(yǎng)基（注：下文中出現(xiàn)的“神經(jīng)元培養(yǎng)基”即指此種添加B-27添加劑和L-谷氨酰胺的神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基）。

（3）注意：剩余的本產(chǎn)品可以等分成工作體積，并儲存在-20 ℃。在以后的試驗中根據(jù)需要解凍相應體積的本產(chǎn)品。避免反復凍融本產(chǎn)品。

（4）對于原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)，神經(jīng)元培養(yǎng)基（由前述步驟制備）需要額外補充25μM的L-谷氨酸，在培養(yǎng)的第4天以后的換液中應不再添加谷氨酸。配置好的培養(yǎng)基，可于 2-8 ℃的避光保存一周。

二、細胞培養(yǎng)步驟

下列步驟已在大鼠胎兒原代皮層神經(jīng)元中測試。

（1）用無菌的冷的 0.05 mg/L 多聚賴氨酸水溶液包被培養(yǎng)表面（玻璃或細胞培養(yǎng)級塑料），每平方厘米表面使用 0.15mL，37℃放置過夜 (16 h)；

（2）去除多聚賴氨酸溶液，并用無菌蒸餾水沖洗兩次（須清洗，因為多聚賴氨酸對細胞有毒性）。在超凈工作臺中打開培養(yǎng)板的蓋子通風，直到每個孔都干燥。培養(yǎng)板干燥后可以立即使用或在4℃ 最多保存 2 周。

（3）根據(jù)實驗室標準操作流程從胚胎 16-18 days 的大鼠中分離獲得原代海馬/皮層神經(jīng)元細胞，或參考細胞株提供的說明書解凍凍存的原代大鼠神經(jīng)元細胞。

（4）將神經(jīng)元培養(yǎng)基在 37℃的水浴鍋中預熱，建議細胞接種密度為 2x105 個/孔（24 孔板為例）或根據(jù)自身實驗對密度進行調(diào)整。

（5）在將接種了細胞的培養(yǎng)皿放置于 37oC，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（6）在接種 16-24 h 后，更換一半體積的新鮮的培養(yǎng)基，之后 2-3 days 換液。

三、分離原代大鼠胚胎神經(jīng)元

下列程序推薦用于培養(yǎng)受精 18 天的大鼠胚胎海馬神經(jīng)元和大腦皮層神經(jīng)元。

（1）從受精 18 天的大鼠胚胎中分離大腦皮層和雙側(cè)海馬。

（2）在預置了培養(yǎng)基的錐形管中收集所有的組織。放置，直到所有的組織都已解體。

（3）使組織沉積在管的底部，然后小心地去除上清液，只留下剛好可覆蓋組織的最少量的培養(yǎng)基。

（4）在不含鈣離子的培養(yǎng)基中，使用 2 mg/L 過濾滅菌的木瓜蛋白酶溶液，在 37 °C 下酶解組織約 30 min，期間輕搖錐形管以幫助降解，5 min/次。每對海馬組織使用 2 mL 酶溶液。

（5）加入兩倍體積的培養(yǎng)基以恢復二價陽離子的濃度，停止酶解。

（6）使未解離的組織沉降至管底（約 2 min），然后把上清液轉(zhuǎn)移到 15 mL 離心管中，離心，150×g，5 min。

（7）在 1 mL 神經(jīng)元培養(yǎng)基中重懸沉淀物，取 10 μL 進行細胞計數(shù)。后續(xù)的操作按照“復蘇和培養(yǎng)凍存的神經(jīng)元”的第 8-10 步驟進行。

四、復蘇和培養(yǎng)凍存的神經(jīng)元

重要提示：原代神經(jīng)元細胞將會貼附在裸露的塑料或玻璃表面，建議事先用神經(jīng)元培養(yǎng)基沖洗所有的塑料和玻璃器皿的內(nèi)表面，以獲得最高的回收率和產(chǎn)量。

由于細胞從凍存狀態(tài)復蘇時極其脆弱，請在整個操作過程中不要震蕩或離心細胞。我們建議每次只解凍一管細胞。務必減少從液氮中轉(zhuǎn)移凍存管到 37oC水浴中的操作時間。

（1）在解凍細胞之前，用神經(jīng)元培養(yǎng)基沖洗無菌的 15 mL 錐形管，然后在超凈工作臺中通風晾干。

（2）從液氮中取出凍存管時可稍微擰松管帽以釋放壓力，然后再擰緊。

（3）在 37 °C 水浴中輕柔攪拌凍存管以快速解凍細胞（小于 2 min）。當觀察到凍存管中只有很少量的冰晶存在時（觸摸凍存管仍然感覺是冷的）從水浴中取出。

（4）在工作臺臺面上輕敲凍存管以使管內(nèi)液體沉降到管底。使用事先用神經(jīng)元培養(yǎng)基沖洗并干燥過的 1 mL 吸頭極其輕柔地將細胞轉(zhuǎn)移到事先沖洗并干燥的 15 mL 錐形管中。

（5）用 1 mL 預熱的神經(jīng)元培養(yǎng)基沖洗沖洗凍存管，以每秒一滴的速度極其緩慢地加入到 15 mL 錐形管中的細胞里。每加一滴都輕柔地轉(zhuǎn)動錐形管一次。不要一次即把全部培養(yǎng)基加到錐形管中。

（6）慢慢地逐滴加入另外 2 mL 預熱的培養(yǎng)基，使管內(nèi)的液體體積為 4 mL。用 1 mL 吸頭輕柔地混合液體，注意不要造成任何氣泡。

（7）用一個事先沖洗干燥過的吸頭吸取 10 μL 細胞懸液加入到含有 10 μL ，0.4 %臺盼藍的微量離心管中，輕敲管壁以混勻溶液。使用手動的細胞計數(shù)方法測定活細胞密度。解凍的細胞的活率應超過 50 %。

（8）在已經(jīng)事先用多聚賴氨酸包被（參見“細胞培養(yǎng)步驟”）的 24 孔板中每孔中接種大約 2x105 個細胞或按所需的細胞密度接種。加入預熱的神經(jīng)元培養(yǎng)基將細胞懸液稀釋到每孔 500 μL。按照“細胞培養(yǎng)步驟”中的 5-6 步驟進行神經(jīng)元的培養(yǎng)。在 37oC，含 5 %CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

五、產(chǎn)品目錄表

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