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成功進(jìn)化出兼具高熱穩(wěn)定、高建庫產(chǎn)量、低接頭自連的T4 DNA連接酶突變體
T4 DNA連接酶（T4 DNA Ligase）是一種由T4噬菌體編碼的酶，以ATP作為輔因子，催化雙鏈DNA或RNA的5’-磷酸與3’-羥基之間形成磷酸二酯鍵。該酶既能催化黏性末端分子間或平末端分子間的連接，也能修復(fù)雙鏈DNA或DNA-RNA雜交雙鏈上的單鏈DNA切口，廣泛用于NGS測序，分子克隆等應(yīng)用。然而，T4 DNA連接酶在實際應(yīng)用中仍存在一些挑戰(zhàn)，包括穩(wěn)定性差、接頭自連率高或DNA建庫產(chǎn)量低等問題。這些問題可能導(dǎo)致實驗效率的降低、數(shù)據(jù)質(zhì)量的下降、實驗結(jié)果的重復(fù)性差以及產(chǎn)物純度低等，進(jìn)而影響分子生物學(xué)實驗的整體效果和測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。為了解決這些問題，翌圣鎂孚泰生物基于ZymeEditorTM創(chuàng)新型酶進(jìn)化平臺對T4 DNA連接酶進(jìn)行了酶改造。
圖1.T4 DNA 連接酶反應(yīng)原理
干濕實驗交互篩選
獲得高性能T4 DNA連接酶
T4 DNA連接酶的結(jié)構(gòu)由緊密纏繞的DNA結(jié)合域（DBD）、核苷酸轉(zhuǎn)移酶（NTase）域以及OB折疊域構(gòu)成。通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，對DNA底物周圍5至20埃范圍內(nèi)的氨基酸殘基進(jìn)行了模擬篩選和結(jié)構(gòu)-功能分析。分析結(jié)果揭示了T4 DNA連接酶中存在一個遠(yuǎn)離活性中心的柔性環(huán)。接著，基于能量計算，設(shè)計了對這個環(huán)區(qū)域的截斷。同時，通過對齊共識序列，并結(jié)合結(jié)構(gòu)與功能數(shù)據(jù)的綜合分析，精心設(shè)計突變體。
圖2.T4 DNA 連接酶
除了采用理性設(shè)計方法外，還通過微孔板篩選技術(shù)（MTPs）對T4 DNA連接酶進(jìn)行了定向進(jìn)化。篩選了超過10^4個突變體的庫后，成功獲得了具有更高穩(wěn)定性和更高活性的T4 DNA連接酶突變體。通過對大量突變體的數(shù)據(jù)分析，從中挑選出有潛力的候選突變體進(jìn)行純化，并準(zhǔn)備進(jìn)行后續(xù)測試。所有通過理性設(shè)計和定向進(jìn)化獲得的突變體，在經(jīng)過精細(xì)純化后，都進(jìn)行了詳盡的表征分析。這包括對其活性、穩(wěn)定性、接頭自連接、DNA片段自連接以及DNA產(chǎn)量的評估，旨在開發(fā)出能夠滿足多樣化應(yīng)用需求的高性能突變體。
數(shù)據(jù)展示
更高的熱穩(wěn)定性
熱穩(wěn)定性分析：翌圣鎂孚泰生物≈供應(yīng)商N(yùn)≈供應(yīng)商A >供應(yīng)商T >供應(yīng)商Q。
建庫產(chǎn)量分析：翌圣鎂孚泰生物≈供應(yīng)商Q≈供應(yīng)商T >供應(yīng)商A >供應(yīng)商N(yùn)。
圖3.42℃熱穩(wěn)定性測試（Molefuture表示翌圣鎂孚泰的T4 DNA連接酶突變體，下同）
更高的建庫產(chǎn)量
1 µg gDNA投入量下的建庫產(chǎn)量分析：翌圣鎂孚泰生物>供應(yīng)商Q≈供應(yīng)商T≈供應(yīng)商A >供應(yīng)商N(yùn)。
0.5 µg gDNA投入量下的建庫產(chǎn)量分析：翌圣鎂孚泰生物≈供應(yīng)商Q≈供應(yīng)商A≈供應(yīng)商T >供應(yīng)商N(yùn)。
圖4.DNA建庫產(chǎn)量分析
更低的接頭自連
0 ng gDNA投入量下的接頭自連分析：供應(yīng)商N(yùn) > 翌圣鎂孚泰生物 > 供應(yīng)商T > 供應(yīng)商A > 供應(yīng)商Q。
0.5 ng gDNA投入量下的接頭自連分析：翌圣鎂孚泰生物 > 供應(yīng)商T > 供應(yīng)商Q ≈ 供應(yīng)商N(yùn) > 供應(yīng)商A。
圖5.投入0、0.5 ng gDNA的接頭自連數(shù)據(jù)
T4 DNA ligase突變體訂購指南
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