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zui近，一則關(guān)于“果凍，老酸奶是由破皮鞋做成的”消息在網(wǎng)上瘋傳，因破皮鞋可以提煉出明膠。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不僅老酸奶，多種果粒酸奶、谷物酸奶，甚至普通酸牛奶中，幾乎都含有中含有明膠、瓊脂、卡拉膠、果膠等食品增稠劑。明膠的品質(zhì)主要取決于原料。通常來說，合格的明膠是從動物鮮皮、骨料內(nèi)提膠，經(jīng)6道提膠工序后，對提取的明膠進(jìn)行蒸發(fā)、干燥，zui后根據(jù)多項控制指標(biāo)進(jìn)行混合形成成品。但為了降低成本，獲得更多利潤，國內(nèi)很多廠家用皮革廠經(jīng)過鞣鉻加工后的藍(lán)礬皮的皮革屑，邊角料、爛皮革等作為生產(chǎn)原料。皮革制成的明膠透明，無味，消費者根本無法將正規(guī)的食用明膠和皮革制成的明膠區(qū)分開來。
皮革水解蛋白是皮革廢料或動物皮毛、臟器等水解生成的一種蛋白粉，對于乳與乳制品中皮革水解蛋白的鑒定，主要是通過對L-羥脯氨酸含量的測定。L-羥脯氨酸是膠原蛋白（皮革水解蛋白）*的氨基酸，在乳酷蛋白中則沒有，所以一旦檢出，則可認(rèn)為可能含有皮革水解蛋白，即可判斷該乳制品中有可能含有由廢棄皮革而來的成分。
賽智科技應(yīng)用質(zhì)檢部采用L-羥脯氨酸衍生方法，利用公司自己的LC-10Tvp液相色譜儀，對L-羥脯氨酸進(jìn)行了分析檢測試驗，并通過公司的VI2010色譜工作站進(jìn)行了詳細(xì)分析，得出的檢測結(jié)果準(zhǔn)確，可靠，供廣大客戶參考使用。
以下是L-羥脯氨酸的測定的詳細(xì)檢測方法：
L-羥脯氨酸的液相色譜儀（HPLC）測定
1 儀器與試劑
1.1 儀器、器皿
1.1.1 LC-10Tvp液相色譜儀
1.1.2 Vertex 色譜柱 250mm×4.6mm×5μm
1.1.3 11 mL水解瓶
1.1.4 1.5 mL塑料離心管
1.1.5 20 mL玻璃具塞刻度試管
1.1.6 5 mL玻璃具塞刻度試管
1.1.7 0.22 μm針頭式過濾器
1.1.8 2 mL樣品瓶
1.2 試劑
1.2.1 甲醇（色譜純）
1.2.2 乙腈（色譜純）
1.2.3 正己烷（色譜純）
1.2.3 三乙胺（色譜純）
1.2.4 冰醋酸（色譜純）
1.2.5 磷酸氫二鈉（無水色譜純）
1.2.6 磷酸二氫鈉（無水色譜純）
1.2.7 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品
1.2.8 蛋白水解試劑：稱取0.1 g苯酚置于100 mL容量瓶，加入50 mL濃鹽酸（36%-38%，摩爾濃度約為12 mol/L），然后加水定容至100 mL。
1.2.9 0.1 mol/L HCl水溶液：量取8.3 mL濃鹽酸，然后用純水定容至1000 mL。
1.2.10 衍生劑PITC溶液：將250 μL異硫氰酸苯酯（PITC）用乙腈定容至10 mL。
1.2.11 三乙胺溶液：將1.4 mL三乙胺用乙腈定容至10 mL。
1.2.12 衍生劑DNFB溶液：0.5 mL 2,4-二硝基氟苯（DNFB）溶于50 mL乙腈。
1.2.13 Na2B4O7緩沖溶液：稱取1.91 g Na2B4O7•10H2O，用50 mL純水溶解。
1.2.14 氨基酸儲備液：稱取一定量L-羥脯氨酸，用0.1 mol/L HCl水溶液溶解，得到濃度為 0.05 mol/L的儲備溶液。
1.2.15 氨基酸使用液：將儲備液用0.1 mol/L HCl水溶液稀釋，得到濃度為0.0003 mol/L的L-羥脯氨酸溶液。
1.2.16 磷酸鹽緩沖溶液：0.02 mol/L Na2HPO4 和NaH2PO4水溶液。
2 實驗方法
2.1 樣品水解
（1） 稱取奶粉0.1 g或牛奶0.68 g置于蛋白水解瓶中（1.1.3），加入蛋白水解試劑（1.2.8），旋緊蓋子，振蕩混勻，110 °C下反應(yīng)24 h。
（2） 反應(yīng)完畢，將反應(yīng)液全部轉(zhuǎn)移至100 mL蒸餾瓶中，75℃下減壓蒸餾至近干。
（3） 用12 mL0.1 mol/L HCl水溶液（1.2.9）分三次溶解殘渣，并轉(zhuǎn)移到20 mL玻璃具塞刻度試管（1.1.5），再用純水定容至20 mL，待衍生。
2.2 樣品衍生
2.2.1 異硫氰酸苯酯（PITC）衍生方法
（1）樣品水解溶液衍生
量取200 μL樣品水解溶液，置于1.5 mL塑料離心管中，加入100 μL三乙胺溶液（1.2.11）和100 μL衍生劑PITC溶液（1.2.10），混勻，室溫反應(yīng)1h，加入400μL正己烷（1.2.3），旋緊蓋子后劇烈振蕩5~10 s，靜置分層，取200 μL下層溶液與800 μL水混合，經(jīng)0.22 μm針式過濾器（1.1.7）過濾，待分析。
（2） 標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化
量取200 μL L-羥脯氨酸使用液*（1.2.15），置于1.5 mL塑料離心管中，加入100 μL三乙胺溶液（1.2.11）和100 μL衍生劑PITC溶液（1.2.10），混勻，室溫反應(yīng)1h，加入正己烷400 μL（1.2.3），旋緊蓋子后劇烈振蕩5~10 s，靜置分層，取200 μL下層溶液與800 μL水混合，經(jīng)0.22 μm針式過濾器（1.1.7）過濾，待分析。
*根據(jù)實際情況，氨基酸使用液濃度可進(jìn)行調(diào)整，本方法中氨基酸使用液濃度僅供參考。
2.2.2 2,4-二硝基氟苯（DNFB）衍生方法
（1） 樣品溶液衍生
取0.5 mL樣品水解溶液置于5 mL玻璃具塞刻度試管（1.1.6）中，加入0.5 mL Na2B4O7緩沖溶液（1.2.13）和0.5 mL衍生劑DNFB溶液（1.2.12），具塞搖勻，于60 °C下避光反應(yīng)1 h。反應(yīng)完畢將試管置于冷水中冷卻，用磷酸鹽緩沖溶液（1.2.16）定容至5 mL，混勻后經(jīng)0.22 μm針式過濾器（1.1.7）過濾，待分析。
（2） 標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生
取0.5 mL L-羥脯氨酸使用液（1.2.15）置于5 mL玻璃具塞刻度試管（1.1.6）中，加入0.5 mL Na2B4O7緩沖溶液（1.2.13）和0.5 mL衍生劑DNFB溶液（1.2.12），具塞搖勻，于60 °C下避光反應(yīng)1 h。反應(yīng)完畢將試管置于冷水中冷卻，用磷酸鹽緩沖溶液（1.2.16）定容至5 mL，混勻后經(jīng)0.22 μm針式過濾器（1.1.7）過濾，待分析。
2.3 色譜條件
2.3.1 異硫氰酸苯酯（PITC）衍生色譜條件
色譜柱： Vertex 色譜柱250mm×4.6mm×5μm
流動相A： 0.05mol/L乙酸鈉水溶液（冰乙酸調(diào)節(jié)PH值為6.50±0.05）
流動相B: 甲醇：乙腈：水=20:60:20（V:V:V）
流速： 1.0 mL/min
檢測波長： UV 254 nm
柱溫： 45℃
進(jìn)樣體積： 10μL
梯度程序：
以下是L-羥脯氨酸的測定的詳細(xì)檢測方法：
L-羥脯氨酸的液相色譜儀（HPLC）測定
1 儀器與試劑
1.1 儀器、器皿
1.1.1 LC-10Tvp液相色譜儀
1.1.2 Vertex 色譜柱 250mm×4.6mm×5μm
1.1.3 11 mL水解瓶
1.1.4 1.5 mL塑料離心管
1.1.5 20 mL玻璃具塞刻度試管
1.1.6 5 mL玻璃具塞刻度試管
1.1.7 0.22 μm針頭式過濾器
1.1.8 2 mL樣品瓶
1.2 試劑
1.2.1 甲醇（色譜純）
1.2.2 乙腈（色譜純）
1.2.3 正己烷（色譜純）
1.2.3 三乙胺（色譜純）
1.2.4 冰醋酸（色譜純）
1.2.5 磷酸氫二鈉（無水色譜純）
1.2.6 磷酸二氫鈉（無水色譜純）
1.2.7 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品
1.2.8 蛋白水解試劑：稱取0.1 g苯酚置于100 mL容量瓶，加入50 mL濃鹽酸（36%-38%，摩爾濃度約為12 mol/L），然后加水定容至100 mL。
1.2.9 0.1 mol/L HCl水溶液：量取8.3 mL濃鹽酸，然后用純水定容至1000 mL。
1.2.10 衍生劑PITC溶液：將250 μL異硫氰酸苯酯（PITC）用乙腈定容至10 mL。
1.2.11 三乙胺溶液：將1.4 mL三乙胺用乙腈定容至10 mL。
1.2.12 衍生劑DNFB溶液：0.5 mL 2,4-二硝基氟苯（DNFB）溶于50 mL乙腈。
1.2.13 Na2B4O7緩沖溶液：稱取1.91 g Na2B4O7•10H2O，用50 mL純水溶解。
1.2.14 氨基酸儲備液：稱取一定量L-羥脯氨酸，用0.1 mol/L HCl水溶液溶解，得到濃度為 0.05 mol/L的儲備溶液。
1.2.15 氨基酸使用液：將儲備液用0.1 mol/L HCl水溶液稀釋，得到濃度為0.0003 mol/L的L-羥脯氨酸溶液。
1.2.16 磷酸鹽緩沖溶液：0.02 mol/L Na2HPO4 和NaH2PO4水溶液。
2 實驗方法
2.1 樣品水解
（1） 稱取奶粉0.1 g或牛奶0.68 g置于蛋白水解瓶中（1.1.3），加入蛋白水解試劑（1.2.8），旋緊蓋子，振蕩混勻，110 °C下反應(yīng)24 h。
（2） 反應(yīng)完畢，將反應(yīng)液全部轉(zhuǎn)移至100 mL蒸餾瓶中，75℃下減壓蒸餾至近干。
（3） 用12 mL0.1 mol/L HCl水溶液（1.2.9）分三次溶解殘渣，并轉(zhuǎn)移到20 mL玻璃具塞刻度試管（1.1.5），再用純水定容至20 mL，待衍生。
2.2 樣品衍生
2.2.1 異硫氰酸苯酯（PITC）衍生方法
（1）樣品水解溶液衍生
量取200 μL樣品水解溶液，置于1.5 mL塑料離心管中，加入100 μL三乙胺溶液（1.2.11）和100 μL衍生劑PITC溶液（1.2.10），混勻，室溫反應(yīng)1h，加入400μL正己烷（1.2.3），旋緊蓋子后劇烈振蕩5~10 s，靜置分層，取200 μL下層溶液與800 μL水混合，經(jīng)0.22 μm針式過濾器（1.1.7）過濾，待分析。
（2） 標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化
量取200 μL L-羥脯氨酸使用液*（1.2.15），置于1.5 mL塑料離心管中，加入100 μL三乙胺溶液（1.2.11）和100 μL衍生劑PITC溶液（1.2.10），混勻，室溫反應(yīng)1h，加入正己烷400 μL（1.2.3），旋緊蓋子后劇烈振蕩5~10 s，靜置分層，取200 μL下層溶液與800 μL水混合，經(jīng)0.22 μm針式過濾器（1.1.7）過濾，待分析。
*根據(jù)實際情況，氨基酸使用液濃度可進(jìn)行調(diào)整，本方法中氨基酸使用液濃度僅供參考。
2.2.2 2,4-二硝基氟苯（DNFB）衍生方法
（1） 樣品溶液衍生
取0.5 mL樣品水解溶液置于5 mL玻璃具塞刻度試管（1.1.6）中，加入0.5 mL Na2B4O7緩沖溶液（1.2.13）和0.5 mL衍生劑DNFB溶液（1.2.12），具塞搖勻，于60 °C下避光反應(yīng)1 h。反應(yīng)完畢將試管置于冷水中冷卻，用磷酸鹽緩沖溶液（1.2.16）定容至5 mL，混勻后經(jīng)0.22 μm針式過濾器（1.1.7）過濾，待分析。
（2） 標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生
取0.5 mL L-羥脯氨酸使用液（1.2.15）置于5 mL玻璃具塞刻度試管（1.1.6）中，加入0.5 mL Na2B4O7緩沖溶液（1.2.13）和0.5 mL衍生劑DNFB溶液（1.2.12），具塞搖勻，于60 °C下避光反應(yīng)1 h。反應(yīng)完畢將試管置于冷水中冷卻，用磷酸鹽緩沖溶液（1.2.16）定容至5 mL，混勻后經(jīng)0.22 μm針式過濾器（1.1.7）過濾，待分析。
2.3 色譜條件
2.3.1 異硫氰酸苯酯（PITC）衍生色譜條件
色譜柱： Vertex 色譜柱250mm×4.6mm×5μm
流動相A： 0.05mol/L乙酸鈉水溶液（冰乙酸調(diào)節(jié)PH值為6.50±0.05）
流動相B: 甲醇：乙腈：水=20:60:20（V:V:V）
流速： 1.0 mL/min
檢測波長： UV 254 nm
柱溫： 45℃
進(jìn)樣體積： 10μL
梯度程序：
| 時間/min | 0 | 39 | 40 | 45 | 46 | 60 |
| 流動相A/% | 95 | 52 | 0 | 0 | 95 | 95 |
| 流動相B/% | 5 | 48 | 100 | 100 | 5 | 5 |
2.3.2 2,4二硝基氟苯（DNFB）衍生色譜條件
色譜柱： Vertex 色譜柱
流動相A： 0.02mol/L Na2HPO4+ 0.02mol/L NaH2PO4水溶液
流動相B: 甲醇：乙腈=10:90（V:V）
流速： 1.0 mL/min
檢測波長： UV 360 nm
柱溫： 35℃
進(jìn)樣體積： 10μL
梯度程序：
色譜柱： Vertex 色譜柱
流動相A： 0.02mol/L Na2HPO4+ 0.02mol/L NaH2PO4水溶液
流動相B: 甲醇：乙腈=10:90（V:V）
流速： 1.0 mL/min
檢測波長： UV 360 nm
柱溫： 35℃
進(jìn)樣體積： 10μL
梯度程序：
| 時間/min | 0 | 35 | 42 | 50 | 60 |
| 流動相A/% | 86 | 60 | 30 | 86 | 86 |
| 流動相B/% | 14 | 40 | 70 | 14 | 14 |
3 色譜圖
賽智科技（杭州）有限公司
市場部 <宣>
2012.04.19
市場部 <宣>
2012.04.19
關(guān)于賽智科技：
賽智科技是目前大的液相色譜儀生產(chǎn)廠家之一，主要產(chǎn)品有：VI2010色譜數(shù)據(jù)工作站、浙大N2000色譜工作站、浙大N2010色譜工作站、N2000色譜工作站SP1版、LC-10Tvp液相色譜儀、STI501液相色譜儀、Vertex5000液相色譜儀、Solar系列光纖光譜儀等。
賽智科技是目前大的液相色譜儀生產(chǎn)廠家之一，主要產(chǎn)品有：VI2010色譜數(shù)據(jù)工作站、浙大N2000色譜工作站、浙大N2010色譜工作站、N2000色譜工作站SP1版、LC-10Tvp液相色譜儀、STI501液相色譜儀、Vertex5000液相色譜儀、Solar系列光纖光譜儀等。
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